入2mg實施例1制備的谷 氨酸-TPGS或TPGS，以及30mg的大豆磷脂和lmg的膽固醇。旋干成膜，加入2mL的去離子 水水化30min，探頭超聲300W，5min，采用微柱離心法除去未包裹的藥物。
[0061] 將實施例2中制備的脂質(zhì)體通過動態(tài)光散射和透視電鏡測定脂質(zhì)體的粒徑大小 和形態(tài)。結(jié)果如圖2,脂質(zhì)體的粒徑約為80nm，粒徑分布窄；透視電鏡圖表明載藥脂質(zhì)體為 粒徑均一的球形。
[0062] 表1為本發(fā)明實施例2的谷氨酸-TPGS修飾的多西他賽脂質(zhì)體和TPGS修飾的多 西他賽脂質(zhì)體（DTX-TGL/DTX-TL)對腦膠質(zhì)瘤細胞C6在72h和96h的IC5。值。
[0063] 表1多西他賽溶液劑，TPGS修飾的多西他賽脂質(zhì)體和TPGS-Glu修飾的多西他賽 脂質(zhì)體對C6膠質(zhì)瘤細胞的IC5。值。
[0064]
[0065] 實施例3
[0066] 谷氨酸-TPGS修飾的多西他賽脂質(zhì)體和TPGS修飾的多西他賽脂質(zhì)體（DTX-TGL/ DTX-TL)的DSC圖
[0067] 按照實例2制備谷氨酸-TPGS/TPGS修飾的多西他賽脂質(zhì)體，并以甘露醇為凍干保 護劑進行凍干，通過DSC分析DTX在脂質(zhì)體中的存在狀態(tài)，分析樣品包括：DTX原料藥，DTX原料藥和空白脂質(zhì)體物理混合物，凍干的DTX-TGL和DTX-TL。
[0068] 圖3結(jié)果表明DTX以無定型或分子態(tài)包裹在磷脂雙分子層中。
[0069] 實施例4
[0070] 谷氨酸-TPGS修飾的多西他賽脂質(zhì)體和TPGS修飾的多西他賽脂質(zhì)體
[0071] (DTX-TGL/DTX-TL)在血漿中的穩(wěn)定性試驗
[0072] 按照實例2制備谷氨酸-TPGS修飾的多西他賽脂質(zhì)體和TPGS修飾的多西他賽脂 質(zhì)體，將脂質(zhì)體置于含有10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液中，通過動態(tài)光散射測定脂質(zhì)體在 Oh,lh, 2h, 4h, 6h, 8h, 10h, 12h和 24h的粒徑。
[0073]圖4結(jié)果表明谷氨酸-TPGS/TPGS修飾的多西他賽脂質(zhì)體具有較好的血漿穩(wěn)定性。
[0074] 實施例5
[0075] 谷氨酸-TPGS修飾的多西他賽脂質(zhì)體和TPGS修飾的多西他賽脂質(zhì)體（DTX-TGL/ DTX-TL)的稀釋穩(wěn)定性
[0076] 按照實例2制備谷氨酸-TPGS修飾的多西他賽脂質(zhì)體和TPGS修飾的多西他賽脂 質(zhì)體，將脂質(zhì)體用PBS稀釋不同倍數(shù)，并通過動態(tài)光散射測定脂質(zhì)體的粒徑。
[0077]圖5結(jié)果表明谷氨酸-TPGS修飾的多西他賽脂質(zhì)體和TPGS修飾的多西他賽脂質(zhì) 體具有較好的稀釋穩(wěn)定性。
[0078] 實施例6
[0079] 谷氨酸-TPGS修飾的多西他賽脂質(zhì)體和TPGS修飾的多西他賽脂質(zhì)體（DTX-TGL/ DTX-TL)體外釋放試驗
[0080] 采用透析法考察實例2制備谷氨酸-TPGS修飾的多西他賽脂質(zhì)體和TPGS修飾的 多西他賽脂質(zhì)體的體外釋藥特征。移取含150μg的載藥膠束溶液于透析袋中，透析袋兩端 夾緊，分別置于含有30mLpH7. 4PBS(含0. 5%Tween80)的釋放介質(zhì)的錐形瓶中，在37°C 恒溫振蕩器中以l〇〇r/min進行體外釋放度考察。分別在1、2、4、6、8、10、12、2處和4811取 樣2mL，同時補充2mL新鮮釋放介質(zhì)，樣品經(jīng)0. 45μm微孔濾膜過濾，取20μL進行HPLC測 定。
[0081]圖6結(jié)果表明谷氨酸-TPGS修飾的多西他賽脂質(zhì)體和TPGS修飾的多西他賽脂質(zhì) 體釋藥緩慢，有利于更多的藥物達到腫瘤部位。
[0082] 實施例7
[0083] 細胞毒性實驗
[0084] 將處于對數(shù)生長期的腦膠質(zhì)瘤細胞（C6)以3. 5X104/孔/0.lmL的DMEM高糖培養(yǎng) 液埋于96孔板中，24h后將實施例2制備的谷氨酸-TPGS修飾的多西他賽脂質(zhì)體和TPGS修 飾的多西他賽脂質(zhì)體以不同濃度分別加入各孔，每孔加入100μL含脂質(zhì)體溶液，每個濃度 3個平行孔，置培養(yǎng)箱中孵育。培養(yǎng)72h和96h后，取出96孔板，每孔加入20μL的5mg/mL MTT，培養(yǎng)箱中孵育4h，甩板，將96孔板倒扣于濾紙中充分吸干殘留液體，每孔加入150μL DMSO于振蕩器中振蕩lOmin，酶標儀測定各孔492nm處的吸光度。計算抑制率：
[0085]抑制率（％ ) = (1-A加藥孔/A對照孔）X100 %
[0086]MTT法測定脂質(zhì)體細胞毒性結(jié)果如圖7和圖8,不同濃度載藥脂質(zhì)體作用于C6細 胞株72h和96h后，細胞抑制率隨藥物濃度和孵化時間增加而增大，并且對細胞的抑制作用 由于谷氨酸的靶向作用而增強。表1所計算得到的各制劑的IC5。值也體現(xiàn)出谷氨酸修飾脂 質(zhì)體的優(yōu)勢。
[0087] 實施例8
[0088] 細胞攝取實驗
[0089] 將LAT1高表達的C6細胞以2X105/孔/0.lmL的1640培養(yǎng)液和DMEM培養(yǎng)液埋于 96孔板中，24h后將實施例2制備的谷氨酸-TPGS修飾的香豆素6脂質(zhì)體和TPGS修飾的香 豆素6脂質(zhì)體，由HBSS緩沖液稀釋相同的香豆素6的濃度加入各孔中，每孔100μL，平行3 孔，置培養(yǎng)箱中孵育lh和3h。棄上清，每孔加入50μ1 0. 5%TrtionX-100 (含0. 2ΝNaOH) 的PBS溶液并置搖床中作用lh。隨后，在激發(fā)波長為458nm，發(fā)射波長為525nm測定細胞內(nèi) 熒光強度，并對每孔進行蛋白含量測定，并計算攝取量。為了篩選最適宜的靶向密度，同時 制備具有不同谷氨酸-TPGS密度修飾的香豆素6脂質(zhì)體，按照上述進行細胞攝取考察。
[0090] 細胞攝取的結(jié)果見圖9,圖10,在LAT1高表達瘤株中，谷氨酸-TPGS修飾的香豆素 6脂質(zhì)體的細胞攝取量均比TPGS修飾的香豆素6脂質(zhì)體高。并且隨著靶向材料修飾密度的 增加，細胞攝取增加，在10 %細胞攝取達到最大。
[0091] 實施例9
[0092] 不同氨基酸底物對LAT1介導的谷氨酸-TPGS修飾的香豆素6脂質(zhì)體攝取的影響 實驗
[0093] 將LAT1高表達的C6細胞以2X105/孔/0.lmL的1640培養(yǎng)液和埋于96孔板中， 24h后將實施例2制備的谷氨酸-TPGS修飾的香豆素6脂質(zhì)體，由HBSS緩沖液稀釋后，與不 同氨基酸混合均勻后，加入各孔中，每孔100μL，平行3孔，置37°C中孵育3h。棄上清，每孔 加入50μ1 0. 5%TrtionX-100(含0. 2NNaOH)的PBS溶液并置搖床中作用lh。隨后，在 激發(fā)波長為458nm，發(fā)射波長為525nm測定細胞內(nèi)熒光強度，并對每孔進行蛋白含量測定， 并計算攝取量。
[0094] 攝取影響實驗結(jié)果見圖11，結(jié)果表明作為LAT1高親和性底物，亮氨酸和苯丙氨酸 對脂質(zhì)體和LAT1的結(jié)合過程有明顯的抑制作用，證明靶向脂質(zhì)體能識別并結(jié)合LAT1，促進 細胞攝取。
[0095] 實施例10
[0096] 谷氨酸-TPGS修飾的DIR脂質(zhì)體和TPGS修飾的DIR脂質(zhì)體的跨血腦屏障能力
[0097] 采用活體成像法考察實例2制備谷氨酸-TPGS/TPGS修飾的DIR脂質(zhì)體和DIR溶 液劑的跨血腦屏障能力。以2mg/kg尾靜脈給予KM小鼠載有DIR的脂質(zhì)體，8h后，將小鼠的 心，肝，脾，肺，腎和腦取出，通過活體成像儀觀察脂質(zhì)體的分布情況。
[0098] 跨血腦屏障能力實驗結(jié)果見圖12,結(jié)果表明作為谷氨酸-TPGS修飾的脂質(zhì)體具有 更好的跨血腦屏障能力。
【主權項】
1. 谷氨酸-TPGS嵌段共聚物，其特征在于：以聚乙二醇為親水端，α -生育酚酯為疏水 端，谷氨酸為靶頭，結(jié)構通式如下：其中，η為11-110,聚乙二醇的分子量為500-5000。2. 根據(jù)權利要求1所述的谷氨酸-TPGS嵌段共聚物，其特征在于，所述的谷氨酸-TPGS 嵌段共聚物為AB型嵌段共聚物，聚乙二醇分子量范圍在500-1000。3. 根據(jù)權利要求1所述谷氨酸-TPGS嵌段共聚物的制備方法，其特征在于采用如下步 驟制備： 將羧基和氨基保護的谷氨酸，溶于適量二氯甲烷、二甲基亞砜等有機良溶劑中，在催化 劑的作用下，避光冰浴I h-2 h，然后與TPGS在30 °C Ν2保護下反應12 h-48 h，經(jīng)分離純 化得到淡黃色固體； 將此淡黃色固體經(jīng)過鈀碳還原反應，脫掉谷氨酸的保護基團，再經(jīng)過進一步分離純化 得到最終化合物-谷氨酸-TPGS嵌段共聚物（Glu-TPGS)。4. 根據(jù)權利要求3所述的制備方法，其特征在于，羧基和氨基保護的谷氨酸為N-芐氧 羰基-L-谷氨酸-1-節(jié)酯。5. 根據(jù)權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述的催化劑為1-(3-二甲基氨基丙 基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽或4-二甲氨基吡啶中的一種或兩種。6. 權利要求1或2所述的谷氨酸-TPGS嵌段共聚物在藥物傳遞系統(tǒng)中的應用。7. 權利要求1或2所述的谷氨酸-TPGS嵌段共聚物作為藥物載體或修飾劑在血腦屏障 及腫瘤主動靶向遞送中的應用。8. 權利要求1或2所述的谷氨酸-TPGS嵌段共聚物作為藥物載體或修飾劑在靶向中性 大氨基酸轉(zhuǎn)運體1中的應用。9. 一種載藥納米粒，其特征在于，以權利要求1或2所述的谷氨酸-TPGS嵌段共聚物為 修飾劑，以脂質(zhì)體為藥物儲庫。10. 根據(jù)權利要求9所述的載藥納米粒，其特征在于：脂質(zhì)體中的藥物為疏水性藥物、 親水性藥或基因類藥物，所述的疏水性藥物為紫杉烷類、喜樹堿類、蒽醌類抗腫瘤藥或二氫 吡啶類、非留體抗炎藥中的任一物質(zhì)或其衍生物；親水性藥物為阿霉素、羥基喜樹堿、順鉑 類；基因類藥物為DNA或SiRNA。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種谷氨酸-TPGS共聚物的制備及該兩親性靶向材料修飾的脂質(zhì)體在疾病靶向傳遞中的應用。所述的兩親性靶向材料，以谷氨酸作為靶頭，聚乙二醇增加靶頭的柔韌性，疏水性的α-生育酚酯為與磷脂的錨釘部位。該靶向材料修飾的脂質(zhì)體可作為多種抗腫瘤藥物靶向傳遞的載體，并能通過表面修飾的谷氨酸與血腦屏障和腫瘤細胞膜上高表達的大中性氨基酸轉(zhuǎn)運體1相互作用，有效提高脂質(zhì)體的跨血腦屏障的能力及細胞攝取和抗腫瘤活性。該脂質(zhì)體穩(wěn)定性好，安全性高，靶向性佳，可用于靜脈注射，有較大的市場應用前景。
【IPC分類】A61K47/34, C08G65/333, C08G65/00, A61K9/127
【公開號】CN105348506
【申請?zhí)枴緾N201510869800
【發(fā)明人】孫進, 何仲貴, 李琳, 狄興盛
【申請人】沈陽藥科大學
【公開日】2016年2月24日
【申請日】2015年12月1日