一種帶電荷納米結(jié)構(gòu)細(xì)胞芯片的制備及應(yīng)用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于納米材料制備，功能材料，生物醫(yī)學(xué)材料以及檢測分析技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及到具有三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)帶電荷的二氧化硅納米結(jié)構(gòu)細(xì)胞芯片的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著科技的發(fā)展，尤其是工業(yè)化進(jìn)程的推進(jìn)，人們的物質(zhì)水平得到了很大的改善，然而任何事情均具有兩面性，是一把雙刃劍。與此同時，環(huán)境問題也逐漸成為大家街頭巷議的焦點(diǎn)，環(huán)境的污染程度令每個人都不寒而栗，霧霾等環(huán)境問題成了大家在健康領(lǐng)域的極大阻力。生活其中，很多疾病應(yīng)運(yùn)而生，尤其是各式各樣的癌癥，奪去了很多人的生命。然而很多疾病發(fā)現(xiàn)之時，卻已是中后期，或者晚期。因此，如何及早發(fā)現(xiàn)，及早治療，防患于未然，或者是防微杜漸，成為了醫(yī)學(xué)界的熱門話題。一般認(rèn)為，一些腫瘤細(xì)胞的檢測分析可以有效地應(yīng)用于早期的診斷治療，以及藥物的療效評估，包括像臨床篩藥，檢測藥物耐藥性等，或者檢測腫瘤是否復(fù)發(fā)，以及研發(fā)一些新的治療藥物等等，隨著現(xiàn)代檢測技術(shù)的應(yīng)用，科學(xué)家和醫(yī)學(xué)家們也研發(fā)了許許多多用于細(xì)胞富集以及檢測的方法和技術(shù)，例如，基于尺寸大小的膜過濾法，免疫磁珠的分離方法等等，然而還有很多問題具有很大挑戰(zhàn)和機(jī)遇。因?yàn)槿梭w血液中的癌細(xì)胞數(shù)量非常的少，處于痕量的級別，大約每幾億的正常細(xì)胞中才發(fā)現(xiàn)一個癌變的腫瘤細(xì)胞，對其檢測的方法和技術(shù)要求非常高，并且儀器也要具備很好的靈敏性才可以高效的檢測分析到目標(biāo)。并且，檢測到的癌細(xì)胞還要具有生物活性，以便進(jìn)行后續(xù)的分析研究。因此，尋找用于檢測癌細(xì)胞的既簡潔又靈敏的方法，成了眾多醫(yī)學(xué)家追逐的目標(biāo)和亟待解決的問題。
[0003]眾所周知，細(xì)胞表面成有一定的電負(fù)性，究其原因，不同生物學(xué)家和醫(yī)學(xué)家從不同的角度都給予的充分的解釋，大家都能接受并且最為直觀的解釋，就是從組成結(jié)構(gòu)分析，因?yàn)榧?xì)胞膜是由磷脂雙分子層的結(jié)構(gòu)作為支架而構(gòu)成，親水的磷酸集團(tuán)在外面，疏水的脂肪酸在里面，磷酸基團(tuán)帶負(fù)電。除了磷脂，糖醛酸也是產(chǎn)生負(fù)電荷的重要原因，還有聚陰離子寡糖在細(xì)胞膜上也有分布。因此，當(dāng)用于檢測的基底表面由帶有氨基官能團(tuán)的化學(xué)物質(zhì)修飾后得到帶正電荷的細(xì)胞芯片，其對細(xì)胞的粘附效率就會有所增加；而當(dāng)用于檢測細(xì)胞的基底由羧基進(jìn)行化學(xué)修飾后得到帶負(fù)電荷的細(xì)胞芯片，其對細(xì)胞的粘附效率自然會有所下降。因此，尋找研發(fā)具有氨基修飾的生物材料，在癌細(xì)胞高效靈敏地檢測分析領(lǐng)域，對科學(xué)家和醫(yī)學(xué)家而言，都具有非常廣闊的發(fā)展前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決以往對癌細(xì)胞粘附檢測分析效率比較低的現(xiàn)狀，本發(fā)明的應(yīng)用材料在于克服已有技術(shù)的不足，提出了在三維拓?fù)浼{米結(jié)構(gòu)表面修飾氨基官能團(tuán)的帶正電荷的細(xì)胞芯片，繼而能夠較好的粘附、檢測、分析癌細(xì)胞的生物醫(yī)學(xué)材料。從而使癌細(xì)胞能夠高效靈敏地被醫(yī)學(xué)家和科學(xué)家檢測分析，最終應(yīng)用于醫(yī)生對患者的診斷治療，造福千千萬萬的癌癥患者，甚至于其他病患身上，為大家的健康保駕護(hù)航。
[0005]—種帶電荷納米結(jié)構(gòu)細(xì)胞芯片的制備方法，其特征在于:
[0006](1).細(xì)胞芯片的基底為三維二氧化硅納米結(jié)構(gòu)；
[0007](2).細(xì)胞芯片基底表面通過不同厚度的煙灰層來制備；
[0008](3).細(xì)胞芯片基底表面用帶有氨基的功能化試劑修飾，得到帶正電荷細(xì)胞芯片；
[0009](4).細(xì)胞芯片基底表面由帶有羧基的功能化試劑來修飾，得到帶負(fù)電荷細(xì)胞芯片;
[0010](5).由氨基官能團(tuán)修飾的細(xì)胞芯片，細(xì)胞粘附數(shù)量較多；由羧基修飾的細(xì)胞芯片，細(xì)胞粘附數(shù)量較少。
[0011]本發(fā)明具體制備步驟如下:
[0012](1)在細(xì)胞芯片的玻璃基底表面制備煙灰層:
[0013]將玻璃基底表面依次用丙酮、乙醇、去離子水等進(jìn)行超聲清洗，待清洗干凈之后再用氮?dú)獯蹈?。然后將干凈的?xì)胞芯片基底置于平穩(wěn)燃燒的火焰上方，均勻的左右移動，控制不同的時間，可以得到不同厚度的煙灰層。
[0014](2)高溫煅燒細(xì)胞芯片基底，生成二氧化硅納米結(jié)構(gòu):
[0015]將表面生成二氧化硅納米結(jié)構(gòu)的細(xì)胞芯片基底，置于潮濕的密閉空間中，在水蒸氣作用下進(jìn)行氣相沉積，使水分子附著在煙灰表面。然后再將其置于密閉的充滿含硅化合物的容器中進(jìn)行氣相沉積。當(dāng)反應(yīng)完成之后，將其置于馬弗爐中，進(jìn)行高溫煅燒。首先經(jīng)過4-5個小時，進(jìn)行升溫至600度，然后保持這個溫度兩個小時，之后讓其自然冷卻至室溫，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用。
[0016](3)將具有二氧化硅納米結(jié)構(gòu)的細(xì)胞芯片基底分別修飾氨基官能團(tuán)、羧基官能團(tuán):
[0017]將含有二氧化硅納米結(jié)構(gòu)的細(xì)胞芯片基底經(jīng)過氧等離子體plasma處理，然后浸沒于體積濃度4%的(3-巰基丙基)三甲氧基硅烷的乙醇溶液當(dāng)中，過夜修飾12個小時，然后乙醇清洗，二甲基亞砜(DMS0)清洗，然后浸沒于濃度為2mM的N-(2-氨乙基)馬來酰亞胺鹽酸的二甲基亞砜溶液，或者濃度為2mM的3-馬來酰亞胺基丙酸的二甲基亞砜溶液當(dāng)中，常溫下放置6h，之后取出用磷酸緩沖液進(jìn)行清洗2-3遍，繼而得到用于細(xì)胞檢測的細(xì)胞芯片。
[0018]所述細(xì)胞芯片的載體包括有玻璃、石英、硅片等。
[0019]細(xì)胞芯片的二氧化硅納米結(jié)構(gòu)可以具有不同厚度的煙灰層，主要是將基片在火焰上方，控制不同的時間，5-15秒。細(xì)胞芯片在火焰上的時間越短，煙灰層就越??；時間越長，煙灰層就越厚。
[0020]煙灰所用的火焰來自于植物油脂，動物油脂，酒精燈，或者蠟燭。
[0021]本發(fā)明在細(xì)胞芯片的表面進(jìn)行細(xì)胞粘附檢測，以及熒光拍攝的具體步驟是將基底置于濃度105/ml的3T3細(xì)胞懸浮液當(dāng)中，然后放在培養(yǎng)箱中15?120分鐘；將已經(jīng)粘附癌細(xì)胞的基底用多聚甲醛進(jìn)行固定，磷酸緩沖液PBS清洗，Triton X-100穿膜，PBS清洗，4, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)，染色 PBS 清洗；之后用 Nikon 焚光顯微鏡進(jìn)行拍攝。
[0022]本發(fā)明的帶電荷的細(xì)胞芯片制備方法簡單，具有良好的光學(xué)性能，高效的捕獲率和粘附率?！靖綀D說明】:
[0023]圖1是本發(fā)明用于細(xì)胞檢測的納米二氧化硅基底的正面的掃描電子顯微鏡圖。
[0024]圖2是本發(fā)明用于細(xì)胞檢測的納米二氧化硅基底的側(cè)面的掃描電子顯微鏡圖。
[0025]圖3是本發(fā)明帶正電荷的細(xì)胞芯片粘附細(xì)胞的環(huán)境掃描電子顯微鏡圖。
[0026]圖4是實(shí)施案例1由氨基修飾的帶正電荷的細(xì)胞芯片和實(shí)施案例2由羧基修飾的帶負(fù)電荷的細(xì)胞芯片分別檢測細(xì)胞數(shù)目的對比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027]實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)一步說明
[0028]實(shí)施例1:取實(shí)驗(yàn)室所用的普通載玻片，切成lcmX lcm的正方形，將玻璃片浸泡在“食人魚”溶液(98% H2S04^P 30% H 202，比例為3:1)中，放置在200°C的加熱板上，加熱1小時左右，取出后分別用丙酮超聲15min、乙醇超聲15min、去離子超聲lOmin，然后用氮?dú)獯蹈?。將清洗好的載玻片放置在平穩(wěn)的蠟燭火焰上方，左右均勻移動15s，即可以得到具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的較厚煙灰層。將得到的樣品置于六孔板的五個孔中，其中一個孔加入3mL的去離子水，將六孔板進(jìn)行密封，室溫放置一個小時。待煙灰層吸附水蒸氣完畢之后，打開六孔板，取出玻璃片，放置于培養(yǎng)皿中，(玻璃片的下面墊一層載玻片)，在培養(yǎng)皿旁邊加入100微升四氯化硅溶液(SiCl4)，密封保存，室溫下放置一個小時，使水蒸氣和四氯化硅發(fā)生水解作用，生成的Si02包覆在煙灰顆粒外，形成Si02外殼。把得到的樣品放在馬弗爐中，調(diào)整程序設(shè)置，使其經(jīng)過5個小時升至60(TC，然后保持加熱2小時，最后自然冷卻，如此便可得到具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的Si02納米結(jié)膜層。
[0029]將制備好的具有二氧化硅納米結(jié)構(gòu)的玻璃片基底進(jìn)行氧等離子體設(shè)備處理(即打plasma)，等離子體處理的功率參數(shù)設(shè)置為200W，時間設(shè)置為300秒，使其表面羥基化，然后置于玻璃儀器中，使(3-巰基丙基)三甲氧基硅烷的乙醇溶液浸沒基底，室溫放置過夜(12小時