一株同溫層芽孢桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物根際促生菌及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株促進(jìn)煙草生長的具 有降解蛋白質(zhì)和解磷，以及產(chǎn)細(xì)胞分裂素功能的同溫層芽孢桿菌及其促生特性的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 煙草是前科（Solanaceae)煙草屬（Nicotiana) -年生草本植物。喜溫、喜光、耐 旱、怕澇、耐瘠、需鉀較多。煙草葉、莖、花萼和果都有多細(xì)胞的毛，其中腺毛細(xì)胞中含有葉綠 素，能綜合含有樹膠和樹脂的滲出物，與煙草的香氣有一定關(guān)系。煙草葉柄不明顯或成翅狀 柄，其圓錐花序頂生，花萼筒狀，花冠漏斗狀，末端粉紅色。蒴果，種子黃褐色。煙草原產(chǎn)于南 美洲，因其葉片含煙堿（尼古?。?，采收后經(jīng)過調(diào)制、分級和加工處理，可制卷煙、雪茄煙、旱 煙等，是煙草工業(yè)重要的原料。近年來我國煙田施肥出現(xiàn)很大的問題，具體表現(xiàn)為：（1)肥 料利用率不高，有資料表明我國烤煙肥料利用率較低，南方一些省份肥料利用率僅20%左 右。其原因是對肥料利用率的相關(guān)性技術(shù)缺乏深入研究，特別是對南方煙區(qū)肥料流失的控 制和北方煙區(qū)的營養(yǎng)吸收障礙等沒有從根本上研究解決；(2)煙田土壤肥力不同程度出現(xiàn) 下降趨勢，由于缺乏良好的培肥地力措施，加之輪作條件差，煙田常年連作，土壤主要營養(yǎng) 元素都不同程度出現(xiàn)下降趨勢，同時土壤物理性狀變劣；（3)營養(yǎng)不平衡，重氮輕磷缺鉀； (4)對旱作煙草的施肥技術(shù)缺乏研究。
[0003] 研究發(fā)現(xiàn)植物根際土壤中含有一些可以促進(jìn)植物生長的微生物，一般有固氮、解 磷、釋鉀、產(chǎn)生植物激素和分泌抗生素等能力或至少具有其中之一能力的細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌等。 統(tǒng)稱為植物根際促生菌（PGPR)，其促生作用機(jī)制主要有以下幾大類：提供植物營養(yǎng)物質(zhì)、 產(chǎn)生植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、植物根際生物修復(fù)劑和環(huán)境脅迫調(diào)節(jié)劑等。但篩選出具有多種功 能且高效的微生物菌株一直是本領(lǐng)域追尋的目標(biāo)。
[0004] 蛋白酶是催化蛋白質(zhì)水解的一類酶，蛋白酶種類的多樣性和水解活性的專一性， 使其在食品、皮革、洗滌劑等工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域成為具有重要商業(yè)價值的工業(yè)酶。土壤中含有大 量蛋白質(zhì)，可以利用PGPR產(chǎn)蛋白酶將土壤中的蛋白質(zhì)分解，產(chǎn)生可以供給煙草使用的氮， 為煙草田提供大量的氮源，這樣就可以減少化肥的使用，避免了對土壤及環(huán)境的破壞。但目 前還未見同時具有高效降解蛋白質(zhì)和解磷，以及產(chǎn)細(xì)胞分裂素功能的同溫層芽孢桿菌及其 促進(jìn)煙草生長的應(yīng)用報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一株同溫層芽孢桿菌及其促進(jìn)煙草生長的應(yīng)用，該菌株具有 降解蛋白質(zhì)和解磷，以及產(chǎn)細(xì)胞分裂素功能。
[0006] 一株同溫層芽孢桿菌（Bacillusstratosphericus)PRl，該菌株保藏編號：CGMCC No.9612〇
[0007] 所述的同溫層芽孢桿菌的培養(yǎng)條件，采用的LB培養(yǎng)基：蛋白胨10g，酵母浸膏5g， NaCllOg，蒸餾水 1000ml，121°C滅菌 20min，培養(yǎng)溫度 37°C，pH7. 0。
[0008] 所述的同溫層芽孢桿菌的應(yīng)用，用于降解蛋白質(zhì)和/或解磷和/或產(chǎn)細(xì)胞分裂素， 從而促進(jìn)植物的生長。所述的的植物包括煙草。
[0009] 本發(fā)明菌株培養(yǎng)后得到菌懸液作為液態(tài)菌劑使用，菌懸液的菌數(shù)濃度cfu多10s 個/mL。菌劑的使用方法：緩苗后灌根，每株煙苗加菌劑lmL。
[0010] 本發(fā)明菌株的菌落及菌體特征為：該菌株在LB培養(yǎng)基（蛋白胨10g，酵母浸膏5g， NaCllOg，蒸饋水1000ml，121°C滅菌20min，溫度37°C，pH7.0。）上培養(yǎng)48h后菌落呈圓 形，半透明，表面光滑，淡黃色，邊緣整齊，菌落稍凸起。菌體呈桿狀，產(chǎn)芽孢，革蘭氏染色陽 性。
[0011] 該菌株的生理生化特征為：甲基紅試驗(yàn)陰性、v-ρ試驗(yàn)陰性、淀粉水解試驗(yàn)陰性、 硝酸鹽還原試驗(yàn)陽性、吲哚試驗(yàn)陰性、硫化氫試驗(yàn)陽性、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)陽性、葡萄糖發(fā) 酵試驗(yàn)陽性、蔗糖發(fā)酵試驗(yàn)陽性、麥芽糖發(fā)酵試驗(yàn)陽性、乳糖發(fā)酵試驗(yàn)陰性、甘露醇發(fā)酵試 驗(yàn)陰性、葡萄糖碳源利用試驗(yàn)陽性、乳糖碳源利用試驗(yàn)陽性、甘露醇碳源利用試驗(yàn)陽性、蔗 糖碳源利用試驗(yàn)陽性、麥芽糖碳源利用試驗(yàn)陽性、檸檬酸碳源利用試驗(yàn)陰性、2 %NaCl耐鹽 試驗(yàn)陽性、5 %NaCl耐鹽試驗(yàn)陽性、7 %NaCl耐鹽試驗(yàn)陽性、10 %NaCl耐鹽試驗(yàn)陽性、產(chǎn)氨 試驗(yàn)陽性。
[0012] 該菌株的最適培養(yǎng)條件為：LB培養(yǎng)基：蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaCl10g，蒸餾水 1000ml，溫度 37 °C，pH7. 0。
[0013] 該菌株可以用于制備微生物菌劑；應(yīng)用時用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)得菌懸液（菌懸液的菌 數(shù)濃度cfu多10s個/mL)，作為液態(tài)菌劑。
[0014] 菌劑的使用方法：緩苗后灌根，每株煙苗加lmL。
[0015] 經(jīng)研究表明，對本發(fā)明的菌株的功能測定結(jié)果如下：在脫脂奶粉的培養(yǎng)基（脫脂 奶粉 3. 0g，瓊脂 3. 0g，去離子水 200mL，ρΗ7· 0 ~7. 2,108°C滅菌 20min。）中培養(yǎng) 24h(37°C) 后測得其菌落半徑為〇.lcm，透明圈半徑為0. 9cm，透明圈與菌落半徑之比為9 ;用國標(biāo)法 以酪蛋白為底物測得PR1的蛋白酶酶活為7.493IU。在蒙金娜固體培養(yǎng)基（葡萄糖10g， (NH4)2S04 0 . 5g，NaCl0.3g，MgS04.7H20 0.3g，F(xiàn)eS04 0 . 03g，MnS04.H20 0.03g，CaC03 5.0g， KC1 0· 3g，Ca3 (P04) 225. 0g，卵磷脂 0· 3g，瓊脂 18 ~20g，pH值 7. 2 ~7. 4。）上培養(yǎng)一周 后，測得第一天其菌落直徑d為1. 5mm，溶磷圈直徑D為5mm，D/d為3. 3,第三天其菌落直徑 d為2. 5mm，溶磷圈直徑D為8. 5mm，D/d為3. 4,第七天其菌落直徑d為3. 5mm，溶磷圈直徑 D為 13mm，D/d為 3. 7 ;在無機(jī)磷液體培養(yǎng)基（葡萄糖 10. 0g，（NH4)2S04 0· 5g，NaCl0· 3g， KC1 0· 3g，MgS04 · 7H20 0· 3g，F(xiàn)eS04 · 7H20 0· 03g，MnS04 · 4H20 0· 03g，Ca3(P04)225. 0g，水 1000mL，pH7. 0-7. 5。）培養(yǎng)4天后，用鉬藍(lán)比色法測定培養(yǎng)液中速效磷的含量變化，從而反 應(yīng)細(xì)菌的解磷能力，測得PR1培養(yǎng)液中速效磷含量為43. 3mg/L。在放有小麥真葉的PR1的 菌懸液中25°C暗室放置4d后目測葉片保綠效果，發(fā)現(xiàn)經(jīng)PR1處理過的葉片依然是綠色，說 明PR1有很好的保綠作用，可以產(chǎn)生細(xì)胞分裂素。盆栽30天時經(jīng)PR1處理的煙株葉片數(shù)略 小于對照，而最大葉片表面積大于對照，但是沒有達(dá)到顯著差異，60天時經(jīng)PR1處理的煙株 莖圍、最大葉片表面積、葉片數(shù)均高于對照，而株高略低于對照，莖圍比對照達(dá)到顯著差異， 90天時經(jīng)PR1處理的煙株株高、葉片數(shù)與對照相比達(dá)到顯著差異，經(jīng)PR1處理的煙草植株的 根、莖、葉、植株總鮮重均好于對照處理，且均達(dá)到顯著差異，在采收后對生物量的統(tǒng)計中可 以看出植株的根、莖、葉干重以及植株總干重均要優(yōu)于對照，同時根干重、莖干重、植株總干 重均在達(dá)到顯著差異。與對照相比，根干重增幅為62. 2%，莖干重增幅為49. 22 %，葉總干 重增幅為13. 97%，植株干重增幅為26. 26%。以上研究結(jié)果表明，PR1菌株可以很好的促 進(jìn)煙草生長，在促進(jìn)煙草生長方面具有潛在的應(yīng)用價值。
[0016] 本發(fā)明同溫層芽孢桿菌（Bacillusstratosphericus)PRl。保藏單位：中國微生物 菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號， 保藏日期：2014年8月28日，保藏編號：CGMCCNo. 9612。
【附圖說明】
[0017] 圖1為60天和90天PR1處理與對照的煙株株高柱形圖；
[0018] 圖2為60天和90天PR1處理與對照的煙株莖圍柱形圖；
[0019] 圖3為30天、60天和90天PR1處理與對照的煙株最大葉表面積柱形圖；
[0020] 圖4為30天、60天和90天PR1處理與對照的煙株葉片數(shù)柱形圖；
[0021] 圖5為PR1處理與對照的煙株鮮生物量柱形圖；
[0022] 圖6為PR1處理與對照的煙株干生物量柱形圖；
[0023] 圖7PR1降解蛋白質(zhì)效果圖；
[0024] 圖8PR1解磷效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0026] 本發(fā)明同溫層芽孢桿菌（Bacillusstratosphericus)PRl，保藏單位：中國微生物 菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號， 保藏日期：2014年8月28日，保藏編號：CGMCCNo. 9612。
[0027] (1)CGMCCNo. 9612 的篩選
[0028] 在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基富集的過程：取采集自湖南桑植官地坪、瀏陽煙科所 的煙草根際土壤，共10個樣品，編號為Gl、G2、G3、G4、G5、Ll、L2、L3、L4、L5,每個土樣稱取 10g，加入100mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，191r/min、37°C搖床振蕩培養(yǎng)24h。
[0029] 以脫脂奶粉為底物降解蛋白質(zhì)的過程：取富集后的培養(yǎng)液經(jīng)梯度稀釋后，從10 \ 10 2、10 3、10 4稀釋度中吸取100μL稀釋液涂布于高氏一號培養(yǎng)基上，在28°C條件下培養(yǎng) 3天；從10 3、10 4、10 5、10 6稀釋度中吸取100μL涂布在PDA培養(yǎng)基上，37°C條件下培養(yǎng)1 天；從10 5、10 6、10 7、10 8稀釋度中吸取100μL涂布在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，37°C條件下 培養(yǎng)1天。
[0030] 待涂布的平板上長出菌后用滅菌牙簽將菌落挑到脫脂奶粉培養(yǎng)基上。觀察選取能 夠產(chǎn)生明顯透明水解圈的細(xì)菌分離物，如此反復(fù)驗(yàn)證多次之后，挑取能穩(wěn)定產(chǎn)生透明圈的 菌株進(jìn)行反復(fù)純化，再在脫脂奶粉培養(yǎng)基上每個平板點(diǎn)種4株菌株，37°C恒溫培養(yǎng)，72h后 測量不同菌株的透明圈和菌落直徑。根據(jù)透明圈與菌落半徑比（HC)值的大小，篩選產(chǎn)蛋白 酶能力相對較強(qiáng)的菌株。將純化后的菌落接種至LB固體斜面培養(yǎng)基中（蛋白胨10g，酵母 浸膏5g，NaCl10g，蒸餾水1000ml，121°C滅菌20min，溫度30°C，pH7.0。）保存。共得到 144株可以降解蛋白質(zhì)的菌株。
[0031] 通過平板透明圈法，國標(biāo)蛋白酶測定法，紫外分光光度法（測生長素含量），保綠 法，解鉀能力測定法，溶磷圈法和鉬藍(lán)比色法分別測定其降解蛋白質(zhì)的能力，產(chǎn)生長素能 力，產(chǎn)細(xì)胞分裂素的能力，解鉀能力和溶磷能力。從分離得到的菌株中篩選出一株既能降解 蛋白質(zhì)又可以解磷又能產(chǎn)細(xì)胞分裂素的菌株，記為PR1。
[0032] (2)CGMCCNo.