60r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24h，作為待測菌液。
[0041] (4)以溫和氣單胞菌（Aeromonassobria)和嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila)作為指示菌，其來自本實(shí)驗(yàn)室的保種（_80°C，20%甘油保存）。分別取保存的 菌種通過接種環(huán)在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板上劃線，28°C恒溫培養(yǎng)12h，分別挑取單菌 落于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基進(jìn)行活化，直至〇D_= 0. 8,儲(chǔ)備在4~8°C冰箱備用。
[0042] (5)通過瓊脂板擴(kuò)散法篩選溫和氣單胞菌和嗜水氣單胞菌的拮抗菌。用直徑為 0. 8mm的打孔器在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板的中央打孔，取步驟（3)中的菌液200yL 加入該孔中，28°C恒溫培養(yǎng)12h，然后取步驟（4)中的指示菌液5yL，加入無菌水直至 100μL，并用玻璃棒均勻涂布在板上，28°C恒溫培養(yǎng)12h。每一種菌三個(gè)重復(fù)。
[0043] (6)用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，并做好記錄，篩選出拮抗菌。
[0044] (7)16SrDNA的擴(kuò)增，取步驟（3)中的拮抗菌的種子液進(jìn)行菌 落PCR，其引物為通用引物：27F:5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '，1492R: 5' -TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3' ；反應(yīng)體系為 25yL，包括ddH20 15.00yL，K0D-Plus buffer2· 5μL，dNTPmix(200mmol/L) 2· 5μL，引物 27F1· 0μL，引物 1492R1· 0μL，菌液 L0μL，KOD-Plus酶(λ5μL，MgS04 (25mmol/L)L5μL。反應(yīng)過程如下：預(yù)變性：95°C，5min， 變性：94°C，lmin，退火：54°C，lmin，延伸：72°C，90s，再延伸：72°C，lOmin。PCR完成后進(jìn)行 1. 2%的瓊脂糖核酸電泳（100V，30min)，片段大約為1500bp，切膠回收PCR產(chǎn)物，克隆到T 載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a(EscherichiacoliDH5a)(市售），PCR檢測陽性克隆，并將 菌液送深圳華大基因測序。結(jié)果如圖4所示，其中，泳道Μ為DNAmarkerDL2000 ;泳道1~ 6為擴(kuò)增的假單胞菌IAS03菌株16SrDNA條帶。
[0045] (8)進(jìn)化樹的建立。將16SrDNA的序列導(dǎo)入EzXtaon專業(yè)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行在線比對(duì) 分析，用Cluxtalx1. 83軟件進(jìn)行多序列匹配排列，分析結(jié)果采用Mega5軟件中的鄰位相連 法（Neighbor-joiningmethod)作出系統(tǒng)進(jìn)化樹，并進(jìn)行自舉分析（Bootstrap)和置信度 檢測，自舉數(shù)據(jù)集1000次。確定詰抗菌株的屬和可能的種。
[0046] (9)形態(tài)學(xué)的鑒定。用接種環(huán)取步驟（3)中拮抗菌的種子液于KB固體平板上劃線， 對(duì)照版為PDA固體培養(yǎng)基。28°C恒溫培養(yǎng)24h后，于波長為302nm的紫外燈下觀察是否有熒 光出現(xiàn)。KB固體培養(yǎng)基：蛋白胨20g、甘油10mL、K2HP04 1.5g、MgS04.7H20 1.5g、瓊脂15~ 20g、水1000mL，pH7.2,121°C、20min高溫滅菌處理。PDA固體培養(yǎng)基：去皮土豆200g、葡萄糖 20g、瓊脂15~20g、水1000mL，pH值7. 0~7.2。具體方法是洗凈土豆，切塊（1X1Xlcm) 水煮20分鐘后，用4層紗布過濾，1000毫升濾液中加入葡萄糖20g和瓊脂15~20g，121°C 滅菌處理20min。
[0047] 分離純化的假單胞菌（Pseudomonasprotegens)IAS03菌株的16SrDNA序列與 Pseudomonasprotegens的16SrDNA序列的相似度為99 %，基于16SrDNA聚類分析顯不 該菌株IAS03與Pseudomonasprotegens聚為一支，且在KB平板上發(fā)出藍(lán)色焚光。結(jié)果如 圖3所示，其中，圖3A為假單胞菌IAS03菌株在PDA固體培養(yǎng)基上的培養(yǎng)結(jié)果；圖3B為假 單胞菌IAS03菌株在KB固體培養(yǎng)基上的培養(yǎng)結(jié)果，在302nm的紫外燈下觀察到藍(lán)色熒光。
[0048] 采用（5)的瓊脂板擴(kuò)散法測得假單胞菌IAS03的菌液對(duì)溫和氣單胞菌和嗜水氣單 胞菌產(chǎn)生的抑菌圈直徑分別為40. 29±0. 85mm和38. 40±0. 69mm。結(jié)果如圖1所示，其中， 圖1A為假單胞菌IAS03菌株的菌液對(duì)嗜水氣單胞菌的抑制效果；圖1B為假單胞菌IAS03 菌株的菌液對(duì)溫和氣單胞菌的抑制效果。
[0049] 在實(shí)驗(yàn)室條件下，取假單胞菌IAS03菌株的活化種子液按照2% (v/v)的接種量 接種于含有250mLLB液體培養(yǎng)基的三角燒瓶（1000mL)中，培養(yǎng)條件為28°C，160r/min振 蕩培養(yǎng)48h，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液經(jīng)冷凍離心機(jī)進(jìn)行7500r/min離心15min，去除菌體，取上 清，進(jìn)行真空冷凍干燥，取干燥粉用無菌水溶解，再離心，取上清用0. 22μm的過濾器過濾， 得10倍無菌發(fā)酵濃縮液，然后采用瓊脂平板擴(kuò)散法，測定其對(duì)溫和氣單胞菌和嗜水氣單胞 菌的抑菌圈直徑。在28°C下恒溫培養(yǎng)12h后，分別對(duì)溫和氣單胞菌和嗜水氣單胞菌產(chǎn)生直 徑16. 88±0. 65mm和14. 03±0. 35mm的抑菌圈。結(jié)果如圖2所示，其中，圖2A為假單胞菌 IAS03菌株的無菌發(fā)酵液10倍濃縮液對(duì)溫和氣單胞菌的抑制效果；圖2B為假單胞菌IAS03 菌株的無菌發(fā)酵液10倍濃縮液對(duì)嗜水氣單胞菌的抑制效果。
[0050] 所述的假單胞菌IAS03菌株的液體培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，牛肉膏蛋 白胨固體培養(yǎng)基則在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基配方基礎(chǔ)上加入瓊脂15~20g/L。
[0051] 所述的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：蛋白胨l〇g/L、牛肉膏3g/L、氯化鈉5g/L， ρΗ7· 0~7. 2,在121°C下滅菌處理20min。
[0052] 所述的假單胞菌IAS03菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基為LB液體培養(yǎng)基，其組分為：蛋白胨 10g/L、酵母提取粉5g/L、氯化鈉10g/L，pH值7. 2,121°C滅菌處理20min。
[0053] 所述的假單胞菌（Pseudomonasprotegens)IAS03 菌株的 16SrDNA序列如SEQID NO:1 所示：（1408bp)
[0054] TGCAGTCGAGCGGCAGCACGGGTACTTGTACCTGGTGGCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGA ATCTGCCTAGTAGTGGGGGATAACGTCCGGAAACGGGCGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGTGGGGGAT CTTCGGACCTCACGCTATTAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGAT CCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGG GGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACT TTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTTACCTAATACGTGATTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCT GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTT GTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTATGGTAGAGGG TGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACT GATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGT CAACTAGCCGTTGGGAGCCTTGAGCTCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGC AAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAG AACCTTACCAGGCCTTGACATCCAATGAACTTTCTAGAGATAGATTGGTGCCTTCGGGAACATTGAGACAGGTGCTG CATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCA GCACGTTATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATG GCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCC CATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCA GAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTA GCTAGTCTAACCTTCGGGAGGACGGTACCA〇
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