用于防治婦女泌尿生殖道感染的彎曲乳酸桿菌的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及彎曲乳酸桿菌及其應(yīng)用，特別涉及用于防治婦女 泌尿生殖道感染的彎曲乳酸桿菌。
【背景技術(shù)】
[0002] 泌尿生殖道感染是嚴(yán)重影響廣大婦女身心健康的常見(jiàn)病，多是大腸桿菌或金黃色 葡萄球菌感染，患病率高達(dá)40% ;其治療主要依靠抗生素，但治愈率偏低，復(fù)發(fā)率可達(dá)40% 以上。
[0003] 為了降低泌尿生殖道感染的復(fù)發(fā)率，臨床上急需新的治療方案。由于抗生素治療 泌尿生殖道感染效果欠佳和抗生素治療引起的肝、腎損害等毒副作用，國(guó)內(nèi)外一直在努力 探索基于益生菌乳桿菌制劑的微生態(tài)療法。微生態(tài)治療是將以殺滅微生物為主要的治療方 法變?yōu)樵黾右嫔?、恢?fù)陰道正常微生態(tài)環(huán)境為目的的新型治療理念。即在利用抗生素清 除致病菌后，直接補(bǔ)充自健康婦女陰道分離的乳桿菌活菌制劑，使其粘附定植下來(lái)，促進(jìn)其 天然的抵抗致病菌生長(zhǎng)的能力。
[0004] -個(gè)完善而有效的益生菌菌種，其本身至少必須具備下述標(biāo)準(zhǔn)：（1)須為宿主應(yīng) 用位置正常定植菌；（2)能在宿主應(yīng)用位置存活并生長(zhǎng)；（3)可提供宿主有益的作用；（4) 相關(guān)產(chǎn)品制成及儲(chǔ)存期間須可維持活性及存活能力。
[0005]目前，國(guó)內(nèi)陰道益生菌菌劑只有一種，其主要成分是德氏乳桿菌活菌。雖然它是從 健康婦女陰道分離出來(lái)的一種乳桿菌，但不是我國(guó)婦女陰道菌群中的正常定值菌。
[0006] 婦女陰道內(nèi)可存在多種細(xì)菌，其中，乳酸桿菌是維持陰道健康微生態(tài)環(huán)境最常見(jiàn) 和最重要的有益菌，乳酸桿菌占健康婦女陰道細(xì)菌總量的90%以上。它們主要通過(guò)產(chǎn)酸、過(guò) 氧化氫抑制病原菌和其他條件致病菌的生長(zhǎng)。如果某些因素引起陰道內(nèi)乳桿菌數(shù)量減少， 甚至完全缺失，則可導(dǎo)致陰道內(nèi)許多條件治病菌異常增殖，并移行至尿道引發(fā)泌尿生殖道 感染。
[0007] 健康婦女陰道內(nèi)存在多種乳桿菌，近期研究證實(shí)健康婦女陰道菌群中具有保護(hù)作 用的優(yōu)勢(shì)菌株是彎曲乳桿菌，彎曲乳桿菌各株間抗致病菌能力差異明顯，具有個(gè)體差異性， 因此，選擇乳桿菌益生菌時(shí)，需要綜合考慮乳桿菌的種類，其產(chǎn)酸、抑菌能力，及與陰道上皮 細(xì)胞粘附的能力，其中乳酸桿菌能否在陰道成功定植，是乳桿菌持續(xù)作用的基礎(chǔ)，也是乳桿 菌發(fā)揮療效的關(guān)鍵因素。
[0008] 由于不同的彎曲乳桿菌株對(duì)陰道上皮細(xì)胞有不同的粘附親和力，親和力強(qiáng)的菌株 定植能力強(qiáng)，才能起到抑殺多種病原微生物的作用。如果乳桿菌活菌制劑不能定植在陰道 上皮細(xì)胞，體外實(shí)驗(yàn)中再?gòu)?qiáng)的抑殺多種病原微生物的作用都無(wú)從談起，變?yōu)榭疹^支票。
[0009] 從健康婦女陰道中分離了百余株彎曲乳桿菌，并從中篩選出既能高效拮抗婦女生 殖道致病菌，又和陰道上皮細(xì)胞具有較高粘附能力的菌株；如用這些優(yōu)選的菌株研制乳酸 桿菌制品，將會(huì)克服目前臨床使用的婦科乳酸桿菌制品的不足，改善婦女泌尿生殖道感染 的治療效果。
[0010] 考慮到我國(guó)龐大的泌尿生殖道感染患病人群和陰道優(yōu)勢(shì)乳桿菌的扶正祛邪的作 用，婦科用乳桿菌制劑開(kāi)發(fā)的市場(chǎng)前景極其光明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一株彎曲乳桿菌（Lactobacillus,crispatus)IMC-25。
[0012] 本發(fā)明提供的一株彎曲乳桿菌（Lactobacillus,crispatus)IMC-25,其保藏號(hào) CGMCCN0. 11344。
[0013] 上述的彎曲乳桿菌或其發(fā)酵產(chǎn)物或其菌懸液或其培養(yǎng)液在制備預(yù)防和/或治療 泌尿生殖道感染產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0014] 上述的彎曲乳桿菌或其發(fā)酵產(chǎn)物或其菌懸液或其培養(yǎng)液在制備抗菌產(chǎn)品中的應(yīng) 用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0015] 上述應(yīng)用中，所述菌為細(xì)菌，所述細(xì)菌具體為金黃色葡萄球菌。
[0016] 上述的彎曲乳桿菌或其發(fā)酵產(chǎn)物或其菌懸液或其培養(yǎng)液在制備粘附陰道上皮細(xì) 胞產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0017] 本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種預(yù)防和/或治療泌尿生殖道感染產(chǎn)品。
[0018] 本發(fā)明提供的產(chǎn)品，其活性成分為上述的彎曲乳桿菌或其發(fā)酵產(chǎn)物或其菌懸液或 其培養(yǎng)液。
[0019] 本發(fā)明第三個(gè)目的是提供一種抗菌產(chǎn)品。
[0020] 本發(fā)明提供的抗菌產(chǎn)品，其活性成分為上述的彎曲乳桿菌或其發(fā)酵產(chǎn)物或其菌懸 液或其培養(yǎng)液。
[0021] 上述產(chǎn)品中，所述菌為細(xì)菌，所述細(xì)菌具體為金黃色葡萄球菌。
[0022] 本發(fā)明第四個(gè)目的是提供一種粘附陰道上皮細(xì)胞產(chǎn)品。
[0023] 本發(fā)明提供的產(chǎn)品，其活性成分為上述的彎曲乳桿菌或其發(fā)酵產(chǎn)物或其菌懸液或 其培養(yǎng)液。
[0024] 上述產(chǎn)品為藥物或菌劑。
[0025]HC-25于2015年9月9日，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中 心（簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)），保藏編號(hào)為CGMCCN0. 11344， 分類命名為彎曲乳桿菌（Lactobacillus,crispatus)。
[0026] 本發(fā)明根據(jù)益生菌菌種的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)，從我國(guó)健康婦女體內(nèi)離了陰道內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌群一 彎曲乳桿菌，并從中篩選出了一株具有較高抑菌能力和與陰道上皮細(xì)胞粘附定植能力強(qiáng)的 益生菌株一彎曲乳桿菌（Lactobacillus,crispatus)IMC-25。實(shí)驗(yàn)證明，將所述彎曲乳桿 菌（Lactobacillus,crispatus)IMC-25,按照106cfu/ml的密度接種于MRS液體培養(yǎng)基，于 厭氧環(huán)境下，37°C靜置培養(yǎng)21h的發(fā)酵液，可有效抑制金黃色葡萄球菌等致病菌的生長(zhǎng)；對(duì) 陰道上皮細(xì)胞較強(qiáng)的粘附作用保證了菌株在陰道上皮的定植。
【附圖說(shuō)明】
[0027] 圖1為從健康人陰道分離的彎曲乳桿菌（Lactobacillus,crispatus)IMC-25抑制 金黃色葡萄球的生長(zhǎng)。
[0028] 圖2為彎曲乳桿菌（Lactobacillus,crispatus)IMC-25與陰道上皮細(xì)胞的粘附作 用。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0030] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0031] 實(shí)施例1、彎曲乳桿菌菌株的分離和鑒定
[0032] -、彎曲乳桿菌菌株的分離
[0033]MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10. 0g;牛肉膏10. 0g;酵母膏5. 0g;檸檬酸氫二銨2. 0g;葡萄 糖 20. 0g;吐溫 80,1.OmL;乙酸鈉（CH3C00Na· 3H20) 5. 0g;磷酸氫二鉀（K2HP04 · 3H20) 2. 0g; 硫酸鎂（MgS04 · 7Η20)0· 58g;硫酸錳（MnS04 ·Η20)0· 25g;蒸餾水lOOOmL;調(diào)至pH6· 2 ~ 6. 6〇
[0034] 收集了 200余例臨床檢測(cè)無(wú)陰道炎癥狀體征的健康婦女陰道分泌物樣品，將樣本 依次編號(hào)，接種于MRS液體培養(yǎng)基，37°C厭氧培養(yǎng)24h。每個(gè)樣本隨機(jī)挑選5個(gè)單菌落于2mL MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)增菌24h，并對(duì)菌落依次編號(hào)。擴(kuò)增細(xì)菌用于細(xì)菌保種與DNA制備。 將分離到的數(shù)百株細(xì)菌分別進(jìn)行菌種鑒定、抑制金黃色葡萄球生長(zhǎng)及與陰道上皮細(xì)胞粘附 作用的檢測(cè)，把其中一株具有較強(qiáng)粘附作用且有效抑制金黃色葡萄球的生長(zhǎng)的彎曲乳桿菌 命名為MC-25。
[0035] 二、彎曲乳桿菌菌株的鑒定
[0036] 1、形態(tài)學(xué)鑒定
[0037] 在MRS乳酸桿菌培養(yǎng)基平板上，上述步驟一分離得到的菌株頂C-25表現(xiàn)為大小約 1-2毫米、不透明、突起的乳白色菌落，且菌落邊緣整齊、較濕潤(rùn)，大小形態(tài)穩(wěn)定。
[0038] 2、生理生化特征分析
[0039] 菌株頂C-25兼性厭氧，生長(zhǎng)最適溫度37-42°C，最適ρΗ5· 8-6. 2。根據(jù)API細(xì) 菌鑒定標(biāo)準(zhǔn)利用API50CHL培養(yǎng)基和API50CH試劑條（bioMe'rieux，Inc.，Marcy l'Etoile，F(xiàn)rance)對(duì)檢測(cè)菌株頂J-1進(jìn)行糖發(fā)酵反應(yīng)判讀檢測(cè)菌株頂C-25的生理生化特 征。API50CHL是由49種可發(fā)酵碳水化合物的API50CH試驗(yàn)條組成的簡(jiǎn)易培養(yǎng)基。以測(cè) 定菌制成懸液接種試驗(yàn)條的每一個(gè)小管。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)，由于發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)酸，pH下降，使 指示劑變色。
[0040] 結(jié)果顯示，菌株MC