改進(jìn)的徒手切割水牛囊胚的方法及切割液的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于胚胎分割技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種改進(jìn)的徒手切割水牛囊胚的方法及切割液。
【背景技術(shù)】
[0002]胚胎分割技術(shù)是20世紀(jì)70年代末逐漸發(fā)展起來的一項(xiàng)生物工程新技術(shù)，通過將2-8細(xì)胞期、桑葚胚、囊胚階段的胚胎一分為二、一分為四或者更多的分割，經(jīng)過體外復(fù)蘇培養(yǎng)后重新復(fù)活發(fā)育，用以擴(kuò)增可用的優(yōu)良胚胎的數(shù)目和生產(chǎn)同卵雙胎、同卵多胎的克隆動(dòng)物，可為遺傳疾病的檢查和性別鑒定等提供一種活體組織采樣和檢查的手段，也可用于瀕危動(dòng)物的保護(hù)。對(duì)于2-8細(xì)胞期的胚胎的切割方法主要有機(jī)械法和化學(xué)輔助機(jī)械法，機(jī)械法主要是使用顯微操作儀，采用玻璃針使在培養(yǎng)液中的胚胎的細(xì)胞團(tuán)從透明帶中脫出，用毛細(xì)管吸住單個(gè)卵裂球，將卵裂球裝入準(zhǔn)備好的透明帶中；化學(xué)輔助機(jī)械法是指使用鏈霉蛋白酶將透明帶消化掉，使卵裂球裸露，再用吸管吹打分離卵裂球，以此獲得單個(gè)卵裂球。一般情況下，哺乳動(dòng)物的胚胎分割主要是在桑葚胚、囊胚階段進(jìn)行，這兩個(gè)階段報(bào)道的切割方法較多，包括Willadsen分割法、Williams分割法、TSuzuki分割法、顯微吸管分離法、酶軟化透明帶顯微玻璃針分割法、徒手分割法等。其中，徒手分割法多用于晚期桑葚胚或囊胚期胚胎的分割，分割時(shí)只需手持顯微手術(shù)刀或玻璃針將整個(gè)胚胎分割為二，這種方法簡(jiǎn)便易行，在現(xiàn)場(chǎng)條件下即可進(jìn)行。
[0003]胚胎分割最先在家兔的胚胎二分割中獲得成功，自20世紀(jì)70年代以來，胚胎分割技術(shù)相繼在小鼠、綿羊、山羊、豬、牛、馬等哺乳動(dòng)物的同胚雙生中獲得成功，有的已經(jīng)用于生產(chǎn)。胚胎切割技術(shù)在我國也取得了比較喜人的進(jìn)展，我國科研工作者先后在奶牛胚胎、山羊胚胎等中進(jìn)行1/2、1/4切割，均獲得了成功。雖然胚胎分割技術(shù)已經(jīng)取得了一定的成就和進(jìn)展，但是仍然有許多方面需要進(jìn)一步完善和發(fā)展，尤其對(duì)于徒手切割胚胎，需要注意掌握切割手法和防止胚胎污染。
[0004]牛磺酸，也稱2-氨基乙磺酸，因最先從牛磺中提取而命名，是一種游離的含硫半必需氨基酸，廣泛存在于動(dòng)物體內(nèi)。?；撬峋哂刑厥獾乃幚碜饔煤蜕砉δ?，研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞發(fā)育過程中，線粒體是活性氧(R0S)產(chǎn)生的主要部位，活性氧對(duì)細(xì)胞有很大的損傷作用，而?；撬嵬ㄟ^發(fā)揮抗脂質(zhì)過氧化作用和膜穩(wěn)定作用，可以保護(hù)線粒體免受脂質(zhì)體過氧化的危害，同時(shí)保持線粒體膜的完整，維持線粒體結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定。同時(shí)，?；撬徇€可以對(duì)過氧化物起到拈抗作用，保護(hù)細(xì)胞膜，減少細(xì)胞死亡，促進(jìn)胚胎發(fā)育，還可起到滲透壓調(diào)節(jié)的作用，通過抑制細(xì)胞膜上NaMCATP酶，有效防止因胚胎內(nèi)K+濃度過高引起的胚胎損害。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種改進(jìn)的徒手切割水牛囊胚的方法及切割液，該法對(duì)切割手法和切割載體進(jìn)行規(guī)范和簡(jiǎn)化，可提高半胚的復(fù)原率，防止污染，保證切割效率。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:改進(jìn)的徒手切割水牛囊胚的方法，包括以下步驟:
[0007]<1>制備切割單層
[0008]<2>固定胚胎
[0009]在體式顯微鏡下，將胚胎放入單層中，將切割刀的刀尖固定在胚胎的9點(diǎn)鐘、12點(diǎn)鐘、15點(diǎn)或18點(diǎn)方向，距離胚胎2-3倍胚胎直徑的距離，以此為支點(diǎn)，然后在胚胎的左右兩邊將切割刀壓下做兩根射線切痕，分別與胚胎左右兩邊相切；
[0010]〈3>切割胚胎
[0011]將胚胎固定在所畫射線內(nèi)，以原支點(diǎn)作為切割射線的原點(diǎn)，沿著胚胎的1/2處壓下切割線進(jìn)行切割，然后以原點(diǎn)為受力點(diǎn)，將切割刀緩慢立起，保持與剛放入單層滴時(shí)一樣的狀態(tài)，如果不需要再進(jìn)行切割操作，將切割刀從切割單層中緩慢抽離；
[0012]〈4>剝離切割胚。
[0013]步驟〈1>中以添加?；撬岬某墒炫囵B(yǎng)液作為切割滴。
[0014]步驟〈1>按以下操作進(jìn)行:在體外成熟培養(yǎng)22_24h后的水牛卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體，用玻璃吸管多次吹打后，挑選出卵母細(xì)胞后剩余的含有顆粒細(xì)胞的成熟培養(yǎng)液用來制作切割滴，同時(shí)向切割滴中添加?；撬?；直接用槍吸取20-5 μ 1的已添加?；撬岬某墒炫囵B(yǎng)液在培養(yǎng)皿上做成滴，覆蓋石蠟油，在39°C,5% C02和最大飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，24小時(shí)后待顆粒細(xì)胞長(zhǎng)滿整個(gè)滴的底部，即可使用。
[0015]牛磺酸的濃度為7X 10 3-9X 10 3mol/L。
[0016]步驟〈4>按以下操作進(jìn)行:用玻璃圓頭分針將切割后的胚胎從非切割面輕輕撥動(dòng)，將切割胚彼此剝離，并將各個(gè)切割塊撥動(dòng)到該單層滴中沒有射線切痕的部位。
[0017]用于上述改進(jìn)的徒手切割水牛囊胚的方法的切割液，該切割液為添加?；撬岵⒑蓄w粒細(xì)胞的成熟培養(yǎng)液。
[0018]?；撬岬臐舛葹?X 10 3-9X 10 3mol/L。
[0019]針對(duì)目前傳統(tǒng)胚胎切割方法存在的問題，發(fā)明人建立了一種改進(jìn)的徒手切割水牛囊胚的方法，并將切割液和培養(yǎng)液合二為一，即將添加一定量?；撬岬暮蓄w粒細(xì)胞的成熟培養(yǎng)液做成切割滴，命名為切割單層。該法主要包括制備切割單層、固定胚胎、切割胚胎、剝離切割胚，其中切割單層時(shí)直接采用添加?；撬岬某墒炫囵B(yǎng)液作為切割滴以取代傳統(tǒng)切割液和培養(yǎng)滴；同時(shí)，該法對(duì)切割手法和切割載體進(jìn)行了規(guī)范和簡(jiǎn)化，方法操作簡(jiǎn)便、無需處理透明帶、切割后無需轉(zhuǎn)移，可提高半胚的復(fù)原率(二分胚復(fù)原率達(dá)90%以上)，防止污染，保證切割效率，為此項(xiàng)技術(shù)能夠真正進(jìn)入實(shí)用和普及階段，更好地為畜牧業(yè)服務(wù)奠定了基礎(chǔ)。
【具體實(shí)施方式】
[0020]實(shí)施例1
[0021]〈0>囊胚的收集
[0022]采集當(dāng)?shù)赝涝讏?chǎng)的廢棄水牛卵巢，置于35°C的生理鹽水的保溫瓶中6h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室，去除多余的卵巢周邊組織后，用18號(hào)注射器吸取2-3ml的洗卵液，抽取卵巢上2-8mm的卵泡中的卵泡液，在體式顯微鏡下，從卵泡液中挑選胞質(zhì)均勻、包裹著3層以上的顆粒細(xì)胞的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)。
[0023]卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)22_24h后，輕輕吹打去除卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)周圍的顆粒細(xì)胞，將裸露的MII期卵母細(xì)胞用體外受精液洗滌2次后放入40 μ 1的受精滴中，每滴約放入15-20個(gè)卵母細(xì)胞，同時(shí)每滴注入處理好的精液12 μ 1，使精子濃度達(dá)到1-2 X 106個(gè)/ml，放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行受精培養(yǎng)；受精后第二天輕輕吹打假定受精卵，去除附著的精子后移入單層顆粒細(xì)胞中共培養(yǎng)，隔天更換一遍培養(yǎng)液，受精后第7-9天收集水牛囊胚。
[0024]其中，
[0025]洗卵液的組成為TCM199+5mmol/L NaHC03+20mmol/L Η印es+0.004ug/ml 肝素鈉+3%新生牛血清+600mg/L青霉素+100mg/L鏈霉素，pH 7.2-7.4 ；
[0026]成熟培養(yǎng)液的組成:TCM199+5mmol/LNaHC03+20mmol/L Η印es+10% 胎牛血清+0.026% 乳酸鈉 +0.5ug/ml FSH+5ug/ml LH，pH 7.2-7.4 ；
[0027]體外受精液的組成:Tyrode’s 液 +20ug/ml Heparin Sodium+2.0mmol/LCaffein