[0076] f.離心機(jī)：Eppendorf公司
[0077] g.純水儀：Milipore公司
[0078] h.微型垂直平板電泳槽：Bi〇-Rad公司
[0079] i.酶標(biāo)儀：TECAN公司
[0080] 2、方法
[0081] 2. 1細(xì)胞培養(yǎng)：骨髓瘤細(xì)胞SP2/0培養(yǎng)于完全1640培養(yǎng)液中，置于37°C、5%的二 氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，隔天換液1次，3-4天傳代1次。
[0082] 2. 2抗原制備：取lmg人α-抗胰蛋白酶溶解于〇. 25mLDMS0溶液中，量取2mmol EDC加入上述溶液中，室溫下避光劇烈搖動(dòng)2h，之后4°C反應(yīng)過夜。人α-抗胰蛋白酶的偶 聯(lián)：將上述溶液緩慢滴加于BSA溶液（2mg蛋白溶于lmL0.lmolL1碳酸氫鈉溶液中），加 入磁力轉(zhuǎn)子，置于磁力振蕩器上，室溫下避光振蕩2h;反應(yīng)產(chǎn)物于0· 05molLipBS緩沖液中 4°C下避光透析72h，每5h更換透析液一次，得到人α-抗胰蛋白酶與載體蛋白BSA的偶聯(lián) 物。
[0083] 2. 3.1小鼠免疫
[0084] 偶聯(lián)后的抗原免疫Balb/c小鼠（4-8周齡，雌性）3只，具體步驟如下：
[0085] a.第一次免疫：人α-抗胰蛋白酶-BSA100μg/只，加等體積福氏完全佐劑充分 混勻后以lmL只皮下多點(diǎn)注射Balb/c小鼠，0. 2mL/點(diǎn)；間隔2周。
[0086] b.第二次免疫：劑量及途徑同上，此次加等體積福氏不完全佐劑，間隔2周。
[0087] c.第三次免疫：劑量同上，此次加等體積福氏不完全佐劑，10天后取被免疫小鼠 的尾靜脈血（采集后即置4°C冰箱過夜，次日以2000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘后留上清備用）， 通過ELISA測(cè)定血清效價(jià)。
[0088] d.第四次免疫：劑量同上，不加佐劑，直接腹腔注射免疫。
[0089] 2. 3. 2ELISA法檢測(cè)被免疫小鼠血清效價(jià)流程：
[0090]a.檢測(cè)前一天，用包被緩沖液稀釋抗原人α-抗胰蛋白酶至15μg/mL，加入酶聯(lián) 免疫吸附板中，每孔1〇〇μL，置4°C冰箱過夜；
[0091] b.次日倒出已包被的酶聯(lián)板孔內(nèi)的液體，以洗滌緩沖液洗滌共3次，每次拍干；
[0092]c.分別加入用PBS行梯度稀釋的待檢血清（血清：PBS分別為1:100 ;1:1000; 1:2000 ;1:4000 ;1:8000 ;1:16000) 100μL7孔，以未免疫的Balb/c小鼠的血清為陰性對(duì) 照，置37°C恒溫水浴箱1小時(shí)；
[0093] d.倒出酶聯(lián)板孔內(nèi)的液體，以洗滌緩沖液洗滌共3次，每次拍干；
[0094]e.每孔加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體（用抗體稀釋液行1:5000的稀 釋）100μL，置37°C恒溫水浴箱1小時(shí)；
[0095]f.倒出酶聯(lián)板孔內(nèi)的液體，以洗滌緩沖液洗滌共3次，每次拍干；
[0096]g.顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液50μL，37°C15分鐘。
[0097] h.結(jié)果判定：酶標(biāo)儀檢測(cè)。
[0098] 通過ELISA檢測(cè)結(jié)果判定三只免疫小鼠均產(chǎn)生針對(duì)人α-抗胰蛋白酶的抗體，取 其中0D值最高（效價(jià)大于10000)的小鼠進(jìn)行后續(xù)步驟。
[0099] 2. 3. 3飼養(yǎng)細(xì)胞的制備（融合前一天取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞）：
[0100] 采用7周齡的Balb/c雌性小鼠；拉頸處死，浸泡于75%酒精中消毒5分鐘，用無菌 剪刀剪開腹部皮膚以暴露腹膜，用無菌注射器每次注射8ml不完全1640培養(yǎng)液，反復(fù)沖洗， 吸出沖洗液放入50mL離心管中（共用約40mL)，以1300轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；棄上清后以完 全1640培養(yǎng)液重懸沉淀，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為4X105個(gè)/mL，加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，500μL/孔， 放入37 °C、5 %的二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0101] 2. 3. 4細(xì)胞融合
[0102] a.觀察骨髓瘤細(xì)胞SP2/0狀態(tài)（要求在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期最佳），將配制好的50%PEG 及20mL不完全1640培養(yǎng)液放入37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱預(yù)熱；（50%PEG的配制：于融合前一天配 制好50 %的PEG置4°C冰箱備用，lg的PEG放入青霉素小瓶后置高壓鍋內(nèi)高壓滅菌后約得 液體lmL，于其內(nèi)加入lmL的PEG配制液即得50%的PEG);
[0103]b.將SP2/0收集于50mL無菌離心管并計(jì)數(shù)（要求細(xì)胞總數(shù)為1X106個(gè)），離心 1300轉(zhuǎn)/分，共7分鐘；
[0104] c.準(zhǔn)備好無菌平皿、篩網(wǎng)、青霉素小瓶，拉頸處死已被四次免疫的BLAB/c小鼠，置 75%酒精中浸泡5分鐘；
[0105] d.取SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞與免疫的Balb/c小鼠脾臟細(xì)胞按1:5-1:10的比例混 合均勻，1300rpm離心7分鐘，棄上清，用手掌輕擊管底，使細(xì)胞松散均勻；
[0106] e.置40°C金屬浴預(yù)熱，用lmL吸管在45s內(nèi)加完預(yù)熱至40°C的lmL50%PEG4000， 邊加邊輕輕振蕩；
[0107] f.然后在90s內(nèi)加入30mL預(yù)熱至37°C的1640不完全培養(yǎng)基，室溫靜置10分鐘；
[0108] 8.1000印111離心5分鐘，棄上清，加入201^含20%胎牛血清和撤1'的1640培養(yǎng)基 重懸，分裝到已有飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)板上，于5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0109] 2. 3. 5雜交瘤的選擇性培養(yǎng)
[0110] 融合24小時(shí)后開始加入選擇培養(yǎng)液，具體過程如下：
[0111] a.融合24小時(shí)后，以HAT1. 6mL及HT0. 4mL加入20mL完全1640培養(yǎng)液中混勻， 加入24孔板內(nèi)，500μL/孔；
[0112] b.隔5天后換液，將24孔板內(nèi)每孔吸出1500μL后，加入擬換的完全1640培養(yǎng)液 (每60mL完全1640培養(yǎng)液中加入0· 6mL的HAT和0· 6mL的ΗΤ組成）；
[0113] c.再隔7天后換液，將24孔板內(nèi)每孔吸出1500μL后，加入擬換的完全1640培養(yǎng) 液（每60mL的完全1640培養(yǎng)液中加入1. 2mL的ΗΤ組成。）。
[0114] 在進(jìn)行c步驟3至7天后，收集24孔板中長(zhǎng)出細(xì)胞集落的培養(yǎng)孔中的細(xì)胞，進(jìn)行 后續(xù)步驟。
[0115] 2. 3. 6分泌抗人α-抗胰蛋白酶多克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的鑒定
[0116] 將2. 3. 5中獲得的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)，取其培養(yǎng)上清進(jìn)行下述步驟：
[0117] a.包被：用0. 05ΜρΗ9. 6的碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為2μg/ mL。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加50μL，4°C過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液 洗3次，每次3分鐘（簡(jiǎn)稱洗滌，下同）。
[0118] b.封閉：在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加含5%的脫脂奶粉（BD公司）PBS 300μL，置37°C孵育2小時(shí)，然后洗滌。
[0119] c.加樣：加一定稀釋的待檢樣品50μL于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37°C孵育1 小時(shí)，然后洗滌（同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽性對(duì)照孔）。
[0120] d.加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入用稀釋液稀釋的的酶標(biāo)抗體（按說明書進(jìn)行 稀釋）50yL。37°C孵育1小時(shí)，洗滌。
[0121] e.加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液50μL，37°C15分 鐘。
[0122] f.終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸50μL。
[0123] g.結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程 度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以" + "、號(hào)表示。也可在ELISA 檢測(cè)儀上于450nm和630雙波長(zhǎng)檢測(cè)0D值，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔0D值，若大于規(guī)定 的陰性對(duì)照0D值的2. 1倍，即為陽性。
[0124] i.結(jié)果：通過酶標(biāo)儀檢測(cè)培養(yǎng)上清，為陽性。
[0125] 2. 3. 7雜交瘤的擴(kuò)大培養(yǎng)及凍存
[0126] a.擴(kuò)大培養(yǎng)：取上清陽性的多克隆細(xì)胞轉(zhuǎn)入24孔板中培養(yǎng)