一種新型果糖苷酶編碼基因的應(yīng)用
【專(zhuān)利說(shuō)明】
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?01310521419. 7、發(fā)明名稱(chēng)為"一種新型果糖苷酶及其編碼基 因和應(yīng)用"、申請(qǐng)日為2013年10月28日的專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新型果糖苷酶編碼基因的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003] 低聚果糖（Fructooligosaccharides，F(xiàn)OS)又名鹿果低聚糖，是指1~9個(gè)果糖基 以β-2,1鍵或β-2,6鍵連接在蔗糖的D-果糖基上而形成的混合物。作為一種被廣泛認(rèn) 可的益生元物質(zhì)，低聚果糖不能被人體直接消化吸收，當(dāng)它到達(dá)人體胃腸道時(shí)，可有選擇性 地刺激腸道中的有益菌（如雙歧桿菌和部分乳酸菌）增殖，同時(shí)代謝產(chǎn)生的短鏈脂肪酸，使 腸道內(nèi)的pH值降低，抑制外源性致病菌和腸道內(nèi)固有真菌等的生長(zhǎng)繁殖，起到調(diào)節(jié)腸道菌 群的作用。
[0004] 微生物之所以具有利用低聚果糖的能力是因?yàn)樗心芊纸獾途酃翘擒真I的 酶，g卩β-咲喃果糖苷酶。β-咲喃果糖苷酶（β-fructofuranosidase，EC3. 2. 1. 26)，又 名轉(zhuǎn)化酶，廣泛地存在于生物界，屬于糖苷酶32家族，具有催化β-呋喃果糖苷分子中非還 原端的β-呋喃果糖苷鍵水解的功能，有的還具有轉(zhuǎn)糖基作用，如用蔗糖作果糖基供體其 能將果糖基轉(zhuǎn)移蔗糖生產(chǎn)低聚果糖。乳桿菌雙歧桿菌來(lái)源的β-呋喃果糖苷酶無(wú)轉(zhuǎn)糖基作 用，其主要功能是水解低聚果糖等碳源供菌體利用。研究發(fā)現(xiàn)，不同來(lái)源的β-呋喃果糖苷 酶的性質(zhì)不同，包括底物動(dòng)力學(xué)、底物多樣性、最適反應(yīng)條件等，使得不同菌株利用低聚果 糖的能力及特性不同。此外，許多具有益生功能的乳酸菌不具有利用低聚果糖的能力，如生 產(chǎn)酸奶的常用菌株保加利亞乳桿菌就不能利用低聚果糖，這就限制了其在人體胃腸道中生 長(zhǎng)并保持活力。
[0005] 因此，基于實(shí)際應(yīng)用的需求，有必要開(kāi)發(fā)新型的果糖苷酶，如果同時(shí)還能實(shí)現(xiàn)其異 源表達(dá)，使得不具有利用低聚果糖能力的益生菌具有利用低聚果糖的能力，則具有更大的 實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有的果糖苷酶類(lèi)型還不夠豐富，還不能滿(mǎn)足 實(shí)際應(yīng)用需求的現(xiàn)狀，而提供一種新型果糖苷酶、其編碼基因、包含該基因的重組表達(dá)載體 及其轉(zhuǎn)化體和所述酶的應(yīng)用，該果糖苷酶來(lái)源于植物乳桿菌，與其他來(lái)源的果糖苷酶相比， 該酶不僅具有分解低聚果糖并從中游離果糖基的酶活性，同時(shí)其還具有菊粉酶活性及果聚 糖酶活性；于其他乳酸菌中異源表達(dá)該酶可以使得不具有利用低聚果糖的乳酸菌獲得利用 低聚果糖的能力。
[0007] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案之一是：一種分離的蛋白質(zhì)，其
[0008] (1)氨基酸序列如序列表中SEQ.IDNO: 1所示；或
[0009] (2)為由氨基酸序列如序列表中SEQ.IDNO: 1所示的蛋白質(zhì)與蛋白純化標(biāo)簽組成 的融合蛋白。
[0010] 本發(fā)明中，所述的蛋白質(zhì)為一種新型的β-呋喃果糖苷酶，在本發(fā)明之前未見(jiàn)報(bào) 道過(guò)，其具有高效的果糖苷酶活性，同時(shí)還兼有菊粉酶活性及果聚糖酶活性。本發(fā)明所述的 蛋白質(zhì)來(lái)源于植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum)ST-III，其可以通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)的 方法獲得，如將編碼所述蛋白質(zhì)的基因?qū)牒线m的宿主細(xì)胞得到能夠正常表達(dá)所述蛋白質(zhì) 的轉(zhuǎn)化體，然后培養(yǎng)所述的轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中分離所述蛋白質(zhì)即可。所述的蛋白質(zhì)還可以 通過(guò)人工全序列合成而得。
[0011] 如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知：所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列可以適當(dāng)引入替換、缺失、改 變、插入或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸而得所述蛋白質(zhì)的同系物，只要該蛋白質(zhì)的同系物依然 能夠保持所述蛋白質(zhì)的功能即可，即在保持所述蛋白質(zhì)的果糖苷酶催化活性、菊粉酶活性 及果聚糖酶活性的前提下，可以進(jìn)行適當(dāng)程度的氨基酸序列改變。
[0012] 本發(fā)明中，所述的蛋白純化標(biāo)簽為本領(lǐng)域常規(guī)所述，較佳地為His純化標(biāo)簽，即本 發(fā)明所述的融合蛋白較佳地為由氨基酸序列如序列表中SEQ.IDNO: 1所示的蛋白質(zhì)與His 純化標(biāo)簽組成的融合蛋白。
[0013] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案之二是：一種分離的核酸，其編碼氨基酸序列如序列表中 SEQ.IDN0:1所示的蛋白質(zhì)。
[0014] 其中所述核酸的制備方法為本領(lǐng)域常規(guī)的制備方法，所述制備方法較佳地包括： 從自然界中提取天然存在的編碼氨基酸序列如序列表中SEQ.IDNO: 1所示的蛋白質(zhì)的核 酸分子，或者通過(guò)基因克隆技術(shù)獲得編碼氨基酸序列如序列表中SEQ.IDNO: 1所示的蛋白 質(zhì)的核酸分子，或者通過(guò)人工全序列合成的方法得到編碼氨基酸序列如序列表中SEQ.ID NO: 1所示的蛋白質(zhì)的核酸分子。
[0015] 本發(fā)明中，所述的核酸優(yōu)選地具有如序列表中SEQ. IDN0:2所示的核苷酸序列，更 優(yōu)選地，所述核酸的核苷酸序列如序列表中SEQ. IDN0:2所示。
[0016] 如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知：編碼氨基酸序列如序列表中SEQ.IDNO: 1所示的蛋白質(zhì) 的核苷酸序列可以適當(dāng)引入替換、缺失、改變、插入或增加一個(gè)或多個(gè)堿基的方式來(lái)提供一 個(gè)多聚核苷酸的同系物，只要該同系物編碼的蛋白質(zhì)依然能夠保持氨基酸序列組成如序列 表中SEQ.IDNO: 1所示的蛋白質(zhì)的功能即可，即在保持氨基酸序列組成如序列表中SEQ.ID NO: 1所示蛋白質(zhì)的果糖苷酶催化活性、菊粉酶活性及果聚糖酶活性的前提下，可以進(jìn)行適 當(dāng)程度的核苷酸序列改變。
[0017] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案之三是：一種包含上述核酸的重組表達(dá)載體。
[0018] 其中所述重組表達(dá)載體可通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)方法獲得，S卩：將上述核酸分子連接 于各種表達(dá)載體上構(gòu)建而成。所述的表達(dá)載體為本領(lǐng)域常規(guī)的各種載體。所述載體較佳 地包括：各種質(zhì)粒、粘粒、噬菌體或病毒載體等，優(yōu)選質(zhì)粒，本發(fā)明所述載體更優(yōu)選為質(zhì)粒 pET-28a(+)，即本發(fā)明所述的重組表達(dá)載體更優(yōu)選為將上述核酸連接于質(zhì)粒pET-28a(+) 上構(gòu)建而成。
[0019] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案之四是：一種包含上述重組表達(dá)載體的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體。
[0020] 其中所述重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體的制備方法為本領(lǐng)域常規(guī)，如可以通過(guò)將上述重組表達(dá) 載體轉(zhuǎn)化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物為本領(lǐng)域常規(guī)的各種宿主微生物，只要 能滿(mǎn)足使上述重組表達(dá)載體穩(wěn)定地自行復(fù)制，且使所攜帶的編碼氨基酸序列組成如序列表 中SEQ.IDNO: 1所示蛋白質(zhì)的基因可被有效表達(dá)即可。其中所述宿主微生物較佳地為：大 腸桿菌（E.coli)，更佳地為大腸桿菌BL21 (DE3)或大腸桿菌DH5α。將前述重組表達(dá)載體 轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)中，即可得本發(fā)明優(yōu)選的基因工程菌株。其中所述轉(zhuǎn)化方法為本 領(lǐng)域常規(guī)的轉(zhuǎn)化方法，較佳地為化學(xué)轉(zhuǎn)化法，熱激法或電轉(zhuǎn)法。
[0021] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案之五是：一種重組乳酸菌，其特征在于，其基因組中含有能 表達(dá)氨基酸序列組成如序列表中SEQ.IDNO: 1所示蛋白質(zhì)的外源基因。
[0022] 本發(fā)明中，所述外源基因的核苷酸序列較佳地如序列表中SEQ.IDN0:2所示，其表 達(dá)氨基酸序列組成如序列表中SEQ.IDNO: 1所示的蛋白質(zhì)。
[0023] 所述的重組乳酸菌為一種能夠利用低聚果糖、獲得水解低聚果糖的重組乳酸菌， 其為能表達(dá)氨基酸序列組成如序列表中SEQ.IDNO: 1所示的蛋白質(zhì)的重組乳酸菌。本發(fā)明 中，所述的乳酸菌為本領(lǐng)域常規(guī)所述的不能產(chǎn)生果糖苷酶、不具有利用低聚果糖能力的常 規(guī)的乳酸菌，優(yōu)選保加利亞乳桿菌（Lactobacillusbulgaricus)ATCC11842菌株。
[0024] 本發(fā)明中，所述的重組乳酸菌可以通過(guò)常規(guī)方法獲得，只要將能表達(dá)氨基酸序列 組成如序列表中SEQ.IDN0:1所示的蛋白質(zhì)的核酸分子（優(yōu)選核苷酸序列如序列表中SEQ. IDN0:2所示）導(dǎo)入所述的乳酸菌基因組中，使之穩(wěn)定表達(dá)即可。較佳地，所述的重組乳酸 菌為通過(guò)穿梭質(zhì)粒PSIP403將能表達(dá)氨基酸序列組成如序列表中SEQ.IDNO: 1所示的蛋白 質(zhì)的核酸分子（優(yōu)選核苷酸序列如序列表中SEQ.IDN0:2所示）導(dǎo)入所述的乳酸菌基因組 中，即：將包含能表達(dá)產(chǎn)生氨基酸序列組成如序列表中SEQ.IDNO: 1所示的蛋白質(zhì)的核酸 分子的穿梭質(zhì)粒PSIP403 (重組表達(dá)載體pSIP403-sacA)導(dǎo)入所述的乳酸菌中，篩選得到重 組乳酸菌