一種酸性高比活木聚糖酶tlxyn11b及其基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種酸性木聚糖酶TLXYN11B及其 基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等是植物細(xì)胞壁的主要組成成分。纖維素大約占細(xì)胞 干重的40~45%，是由葡萄糖通過β-1，4-糖苷鍵連接而成的線狀結(jié)構(gòu)分子。木質(zhì)素約占 細(xì)胞干重的15~25%，是一種復(fù)雜酚類聚合物。半纖維素約占細(xì)胞干重的30~35%，是 繼纖維素之后最豐富的可再生生物資源。半纖維素包括木聚糖，甘露聚糖，半乳聚糖等等， 完全降解半纖維素舉要多種酶的協(xié)同作用，其中木聚糖酶是一種切割β-1，4-糖苷鍵的主 要酶類（Collinsetal.FEMSMicrobiologyReviews. 2005, 29:3-23·)。在食品，飼料和紙 漿工業(yè)等方面有廣闊的應(yīng)用前景。
[0003] 在啤酒釀造過程中，麥芽中的木聚糖造成啤酒過濾困難、堵塞過濾膜，增加 了啤酒的生產(chǎn)成本和品質(zhì)，采用酸性木聚糖酶和木聚糖酶協(xié)同作用，可以解決以上 問題。在飼料制粒時(shí)，熱穩(wěn)定性優(yōu)良的木聚糖酶可以較少的損失酶活，并在進(jìn)食過 程中輔助消化提高營(yíng)養(yǎng)（FlintandBayer.AnnalsoftheNewYorkAcademyof Sciences. 2008, 1125:280 - 288.)。而在紙漿漂白時(shí)，木聚糖酶可以替代部分有機(jī)氯化物， 從而減少環(huán)境污染（Gangwar,etal.Bioresources· 2014, 9 (2) : 3733-3754.) 〇
[0004] 本發(fā)明克隆和分離的酸性嗜熱木聚糖酶pH穩(wěn)定性非常好，可以適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)中 的強(qiáng)酸和一定的強(qiáng)堿環(huán)境，可以更好的應(yīng)用于飼料、釀酒和造紙工業(yè)。本發(fā)明中的木聚糖酶 在pH2. 0-5. 5下均具有較高酶活力，具有優(yōu)良的pH穩(wěn)定性，在pHl~11之間保持穩(wěn)定，表 現(xiàn)出較高的木聚糖酶活性，并對(duì)于地衣多糖和羧甲基纖維素鈉（CMCNa)具有一定的降解能 力，因而在飼料，啤酒，造紙等工業(yè)中，具有一定的應(yīng)用前景。
[0005] 由于不同工業(yè)對(duì)木聚糖酶性質(zhì)需求不同，因此，獲得新型具有優(yōu)良特性木聚糖酶 的研究仍具有重大意義。本次克隆和分離的酸性的木聚糖酶比活力非常高，可以有效降低 其在工業(yè)應(yīng)用中的成本，可以更好的應(yīng)用于飼料、釀酒，食品工業(yè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種能高效應(yīng)用的酸性木聚糖酶。
[0007] 本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述酸性木聚糖酶的基因。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。
[0009] 本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。
[0010] 本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述酸性木聚糖酶的基因工程方法。
[0011] 本發(fā)明的另一目的提供上述酸性木聚糖酶的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明從藍(lán)狀菌（TalaromycesleycettanusJCM12802)中分離得到一種新的酸 性木聚糖酶TIXynllB。
[0013] 本發(fā)明提供了一種酸性木聚糖酶TIXynllB，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0014] SEQ ID NO. 1：
[0015] MVSFSSLALGFSAVAGVFAAPSELSKRQTLTSSSTGTSGGYYYSFWTNGGGTVDYTNGNGGEYSVTWEN CGDFTAGKGWNPGGYRSVTYSGSFNPSGNAYLSVYGWTTNPLVEYYILENYGDYNPGSSMTYKGSVYSDGSTYDIYE HQQVNQPSIEGTATFNQYWSIRQNKRSSGTVTTGNHFNAWASLGMNLGEFNYMIVSTEGYESSGSSSITVS
[0016] 其中，該酶包括217個(gè)氨基酸，N端19個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列 "MVSFSSLALGFSAVAGVFA"（SEQ ID N0. 3)。
[0017] 因此，成熟的酸性木聚糖酶TIXynllB的理論分子量為21.9kDa，其氨基酸序列如 SEQ IDN0. 2所示：
[0018] APSELSKRQTLTSSSTGTSGGYYYSFWTNGGGTVDYTNGNGGEYSVTWENCGDFTAGKGWNPGGYRSVT YSGSFNPSGNAYLSVYGWTTNPLVEYYILENYGDYNPGSSMTYKGSVYSDGSTYDIYEHQQVNQPSIEGTATFNQYW SIRQNKRSSGTVTTGNHFNAWASLGMNLGEFNYMIVSTEGYESSGSSSITVS
[0019] 本發(fā)明的木聚糖酶TIXynllB同時(shí)具有好的pH穩(wěn)定性，并且常溫下在酸性范圍 (ρΗ2· 0-6.0)內(nèi)均具有高活性等特性。本發(fā)明篩選到Talaromyces leycettanus JCM12802 所產(chǎn)生的木聚糖酶，其最適pH值為3. 5,在pHl. 0~11. 0的范圍內(nèi)維持80%以上的酶活性； 最適溫度為65-70 °C。
[0020] 本發(fā)明提供了編碼上述酸性木聚糖酶TIXynllB。具體地，該基因的基因組序列如 SEQ ID N0. 4所示：
[0021] Atggtgtccttctcctccctcgcccttggcttctccgccgtcgcgggagtcttcgccgctcctagcgag ctctccaaacgccaaacactaacctcaagctccactggcaccagtggtggctactactactccttctggactaatgg tggcggaacggtcgactacactaatggcaatggtggtgaatacagtgtcacctgggaaaattgtggtgactttactg ctggaaagggctggaatcctggaggttacaggagtgttacatactctggtagctttaatccttcgggtaatgcttat ctctctgtctatggctggactaccaaccctcttgttgagtactatattctcgaaaactatggcgactataaccccgg ctccagcatgacatacaagggaagtgtttatagtgatggatcaacatatgacatctatgagcaccaacaagtcaatc aaccctctattgaaggcactgcgaccttcaaccagtactggtctatccgccaaaacaaacgttccagtggaactgtc accactggaaatcactttaacgcatgggccagcctcggaatgaatttgggtgaatttaactacatgattgtctccac tgagggatatgagagcagcgggtcctcttccattactgtttcctag
[0022] 本發(fā)明通過PCR的方法分離克隆了木聚糖酶基因TIXynllB，DNA全序列分析結(jié)果 表明，木聚糖酶TIXynllB結(jié)構(gòu)基因TIXynllB全長(zhǎng)654bp。其中，信號(hào)肽的堿基序列為：
[0023] ATGGTGTCCTTCTCCTCCCTCGCCCTTGGCTTCTCCGCCGTCGCGGGAGTCTTCGCC(SEQ ID NO. 6)〇
[0024]成熟的木聚糖酶TLXYN11B的基因序列如SEQ ID NO. 5所示。
[0025] SEQ ID NO. 5
[0026] Gctcctagcgagctctccaaacgccaaacactaacctcaagctccactggcaccagtggtggctactac tactccttctggactaatggtggcggaacggtcgactacactaatggcaatggtggtgaatacagtgtcacctggga aaattgtggtgactttactgctggaaagggctggaatcctggaggttacaggagtgttacatactctggtagcttta atccttcgggtaatgcttatctctctgtctatggctggactaccaaccctcttgttgagtactatattctcgaaaac tatggcgactataaccccggctccagcatgacatacaagggaagtgtttatagtgatggatcaacatatgacatcta tgagcaccaacaagtcaatcaaccctctattgaaggcactgcgaccttcaaccagtactggtctatccgccaaaaca aacgttccagtggaactgtcaccactggaaatcactttaacgcatgggccagcctcggaatgaatttgggtgaattt aactacatgattgtctccactgagggatatgagagcagcgggtcctcttccattactgtttcctag
[0027] 成熟蛋白理論分子量為21. 9kDa，將木聚糖酶基因TIXynllB序列進(jìn)行BLAST比對(duì)， 證明TIXynllB是一種新的木聚糖酶。
[0028] 本發(fā)明還提供了包含上述酸性木聚糖酶基因TIXynllB的重組載體，優(yōu)選為 pPIC-TIXynllB。將本發(fā)明的木聚糖酶基因插入到表達(dá)載體合適的限制性酶切位點(diǎn)之間， 使其核苷酸序列可操作的與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方 案，優(yōu)選為將本發(fā)明的木聚糖酶基因插入到質(zhì)粒PPIC9上的EcoRI和NotI限制性酶切 位點(diǎn)之間，使該核苷酸序列位于A0X1啟動(dòng)子的下游并受其調(diào)控，得到重組酵母表達(dá)質(zhì)粒 pPIC9-TlXynllB〇
[0029] 本發(fā)明還提供了包含上述酸性木聚糖酶基因TIXynllB的重組菌株，優(yōu)選所述菌 株為酵母菌，優(yōu)選為重組菌株GS115/TlXynllB。
[0030] 本發(fā)明還提供了一種制備酸性木聚糖酶TIXynllB的方法，包括以下步驟：
[0031] 1)用上述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；
[0032] 2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組木聚糖酶表達(dá)；以及
[0033]