供了一種制備α- 丁酮酸的蘇氨酸脫氨 酶；本發(fā)明中所述α- 丁酮酸的制備方法具有催化能力高底物累積可達600g/L以上，轉(zhuǎn)化 率達95%以上、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好等優(yōu)點，在35°C條件下對L-蘇氨酸脫氨酶的酶活 達到10156. 5U/g，L-蘇氨酸的轉(zhuǎn)化率達到100%，為α-丁酮酸的大規(guī)模生產(chǎn)并為其作為 前體的系列關(guān)鍵手性中間體提供了良好的技術(shù)支持，具有較高的工業(yè)化應(yīng)用潛力。 (四）【附圖說明】
[0057] 圖1為pET28b_EcTD重組質(zhì)粒物理圖譜。
[0058] 圖2為蘇氨酸脫氨酶SDS-PAGE圖；其中泳道2為蛋白質(zhì)分子量Marker，泳道1為 細(xì)胞破碎上清液。 (五）【具體實施方式】
[0059] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于 此：
[0060] 以下實施例所用主要實驗材料來源為：
[0061] 大腸桿菌宿主菌株E.coliBL21 (DE3)購自Invitrogen公司，表達載體pET28b(+) 購自Novagen公司，限制性內(nèi)切酶NcoI和XhoI購自Fermentas公司，T4DNA連接酶和 卡那霉素均購自大連寶生物有限公司，異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG)為Promega 公司產(chǎn)品，DNAMarker和染色劑GoldView購自TaKaRa公司，AxygenDNA凝膠回收試劑 盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、PCR純化試劑盒購自Axygen生物技術(shù)有限公司。
[0062] 本發(fā)明實施例所述LB平板培養(yǎng)基組成為（g/L):蛋白胨10,酵母粉5,氯化鈉10， 瓊脂20,溶劑為水，pH值自然。
[0063] 本發(fā)明所述LB液體培養(yǎng)基組成為（g/L):蛋白胨10,酵母粉5,氯化鈉10,溶劑為 水，pH值自然。
[0064] 實施例1:蘇氨酸脫氨酶EcTD氨基酸序列、核酸序列的獲得
[0065] 利用蛋白質(zhì)PDB和NCBI數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)對蘇氨酸脫氨酶基因序列進行篩選，得到一 個蘇氨酸脫氨酶基因。該蘇氨酸脫氨酶來源于大腸桿菌（Escherichiacoli)，根據(jù)該蘇 氨酸脫氨酶的氨基酸序列，并依據(jù)大腸桿菌偏好的密碼子進行密碼子優(yōu)化，根據(jù)表達載體 pET28b(+)的特點設(shè)計了酶切位點XhoI和NcoI，通過基因工程的常規(guī)操作以全合成的方 法合成了該段蘇氨酸脫氨酶基因EcTD(SEQIDN0 :2所示），編碼酶的氨基酸序列如SEQID NO:1所示。
[0066] 實施例2:重組表達載體pET28b(+) -EcTD的構(gòu)建以及重組工程菌的構(gòu)建
[0067] 利用XhoI和NcoI限制性內(nèi)切酶對實施例1合成的蘇氨酸脫氨酶基因EcTD 片段進行雙酶切以及回收處理，并利用T4DNA連接酶將該片段同用相同的限制性內(nèi)切 酶處理的商業(yè)化載體pET28b(+)在16°C下進行連接16h，從而構(gòu)建得到胞內(nèi)重組表達載 體pET28b(+) -EcTD，結(jié)果見圖1所示。將構(gòu)建的胞內(nèi)表達載體pET28b(+) -EcTD轉(zhuǎn)化至 E.coliBL21(DE3)(InVitr〇gen)受體菌中，涂布于含卡那霉素（終濃度為50yg/mL)的 LB瓊脂平板上，37°C下培養(yǎng)過夜，第二天于平板上長出的菌落中隨機挑取克隆并抽提質(zhì)粒 進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果見圖2所示，篩選獲得重組基因工程菌E.coliBL21 (DE3)/ pET28b(+)-EcTD〇
[0068] 實施例3:含有蘇氨酸脫氨酶基因EcTD菌體細(xì)胞的制備
[0069] 將實施例2構(gòu)建的重組基因工程菌E.coliBL21 (DE3) /pET28b(+) -EcTD接種至含 有50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，在37°C培養(yǎng)10h，再以1. 5%接種量（v/v)接種至 新鮮的含有50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至菌體濃度0D600約0. 8左 右，再向LB液體培養(yǎng)基中加入終濃度為0.ImM的IPTG，28°C誘導(dǎo)培養(yǎng)10h后，將培養(yǎng)液在 4°C、lOOOOrpm離心10min，棄去上清液，收集濕菌體，即為含有胞內(nèi)表達重組蘇氨酸脫氨酶 的大腸桿菌BL21 (DE3) /pET28b-EcTD濕菌體。
[0070] 實施例4:重組基因工程菌E. coli BL21 (DE3)/pET28b_EcTD在α- 丁酮酸制備中 的應(yīng)用
[0071] 在本實施例中，按照實施例3方法獲得含有胞內(nèi)表達重組蘇氨酸脫氨酶的大腸桿 菌E.coliBL21 (DE3) /pET28b-EcTD濕菌體作為酶源，以L-蘇氨酸為底物，進行生物轉(zhuǎn)化反 應(yīng)制備α- 丁酮酸。轉(zhuǎn)化體系組成及轉(zhuǎn)化操作如下：在l〇mL磷酸鈉緩沖液（pH= 7. 0)中 加入0.lg濕菌體和2. 40gL-蘇氨酸構(gòu)成反應(yīng)體系。35°C、180rpm條件下反應(yīng)，每隔lh取 樣，每次取300μL樣品，離心（12000Xg，2min)，吸取上清，樣品稀釋后供氨基酸分析儀分 析。反應(yīng)l〇h，L-蘇氨酸轉(zhuǎn)化率達到為99. 5%。
[0072] 反應(yīng)液中L-蘇氨酸的含量由自動氨基酸分析儀測定。氨基酸分析儀的型號為 S-433D(SYKAM，Germany)，所用分離柱為鈉系統(tǒng)分離柱（蛋白水解用）。色譜條件為：進樣 量50. 0μL，采用標(biāo)準(zhǔn)蛋白水解分離程序。
[0073] 酶活單位定義：在一定的反應(yīng)條件下，每min催化1 μπιο? L-蘇氨酸所需的酶量為 lU〇
[0074] 實施例5:重組基因工程菌Ε· coli BL21 (DE3)/pET28b_EcTD在α- 丁酮酸制備中 的應(yīng)用
[0075] 在本實施例中，以按照實施例3方法獲得的重組基因工程菌E.coliBL21 (DE3)/ pET28b-EcTD為酶源，在100mLTris-HCl緩沖液（pH= 6. 5)中加入(λ5g濕菌體（終濃 度5g/L)和24. 0gL-蘇氨酸構(gòu)成反應(yīng)體系。40°C、180rpm條件下反應(yīng)，每隔lh取樣，每次 取300μL樣品，離心（12000Xg，2min)，吸取上清，樣品稀釋后供氨基酸分析儀分析。反應(yīng) 14h，轉(zhuǎn)化率達到99. 0%。
[0076] 實施例6:重組基因工程菌E. coli BL21 (DE3)/pET28b_EcTD在α- 丁酮酸制備中 的應(yīng)用
[0077] 在本實施例中，以按照實施例3方法獲得的重組基因工程菌E.coliBL21 (DE3)/ pET28b-EcTD為酶源，在10mL磷酸鈉緩沖液（pH= 6. 0)中加入(λlg濕菌體（終濃度10g/ L)和4. 8gL-蘇氨酸構(gòu)成反應(yīng)體系。25°C、200rpm條件下反應(yīng)，每隔lh取樣，每次取300μL 樣品，離心（12000Xg，2min)，吸取上清，樣品稀釋后供氨基酸分析儀分析。反應(yīng)20h，轉(zhuǎn)化 率達到95%。
[0078] 實施例7:重組基因工程菌E. coli BL21 (DE3)/pET28b_EcTD在α- 丁酮酸制備中 的應(yīng)用
[0079] 在本實施例中，以按照實施例3方法獲得的重組基因工程菌E.coliBL21 (DE3)/ pET28b-EcTD為酶源，在10mLTris-HCl緩沖液（pH= 7. 0)中加入(λ05g濕菌體（終濃度 5g/L)和1.2gL-蘇氨酸構(gòu)成反應(yīng)體系。45°C、180rpm條件下反應(yīng)，每隔lh取樣，每次取 300μL樣品，離心（12000Xg，2min)，吸取上清，樣品稀釋后供氨基酸分析儀分析。反應(yīng)3h， 轉(zhuǎn)化率達到98%。
[0080] 實施例8:重組基因工程菌E. coli BL21 (DE3)/pET28b_EcTD在α- 丁酮酸制備中 的應(yīng)用
[0081] 在本實施例中，按照實施例3方法獲得的重組基因工程菌E.coliBL21(DE3)/ pET28b-EcTD作為生物催化劑，在20mLTris-HCl緩沖液（pH= 0)中加入(λ6g濕菌體 (終濃度分別為30g/L)，底物L(fēng)-蘇氨酸12g構(gòu)成反應(yīng)體系。35°C、180rpm條件下反應(yīng)，每隔lh取樣，每次取300μL樣品，離心（12000Xg，2min)，吸取上清，樣品稀釋后供氨基酸分析 儀分析。反應(yīng)30h，轉(zhuǎn)化率分別達到95.Ο%。
[0082] 實施例9:α- 丁酮酸的提取
[0083]按照實施例5獲得的轉(zhuǎn)化液，離心去除大腸桿菌細(xì)胞，上清液減壓蒸餾至1/2體 積，除去反應(yīng)液中殘留的氨。80°C保溫40min，使蛋白質(zhì)變性，離心去除變性蛋白；為了更好 地去除培養(yǎng)基和細(xì)胞內(nèi)含物殘留的色素，加熱時可以在反應(yīng)中加入少量的活性炭脫色，再 用循環(huán)水式真空栗進行抽濾，收集澄清的濾液。然后進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去水，得到α-丁酮 酸，純度在98%以上。
[0084]由上述實驗結(jié)果可知，本發(fā)明得到的含有蘇氨酸脫氨酶基因的重組大腸桿菌具有 較強的催化水解能力，可直接以含酶的菌體細(xì)胞為酶源進行生物催化或者轉(zhuǎn)化反應(yīng)。蘇氨 酸脫氨酶EcTD作為生物催化劑，可以利用L-蘇氨酸為底物，進行生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)制備α- 丁 酮酸。針對本發(fā)明得到的重組基因工程菌可通過發(fā)酵，進一步擴大反應(yīng)體系，具有很大的工 業(yè)化應(yīng)用前景。
[0085]上述實施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)特點以及構(gòu)思，其目的在于讓熟悉此項技術(shù)的 人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍。凡根據(jù)本發(fā) 明精神實質(zhì)所做的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種蘇氨酸脫水酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列為SEQIDNO:1所示。2. -種權(quán)利要求1所述蘇氨酸脫水酶的編碼基因，其特征在于所述編碼基因的核苷酸 序列為SEQIDNO:2所示。3. -種由權(quán)利要求2所述蘇氨酸脫水酶編碼基因構(gòu)建的重組載體。4. 一種由權(quán)利要求3所述重組載體轉(zhuǎn)化獲得的重組基因工程菌。5. -種權(quán)利要求2所述蘇氨酸脫水酶編碼基因在制備蘇氨酸脫水酶中的應(yīng)用，其特征 在于所述的應(yīng)用為：構(gòu)建含有所述蘇氨酸脫氨酶基因的重組載體，將所述重組載體轉(zhuǎn)化至 大腸桿菌中，誘導(dǎo)培養(yǎng)，從培養(yǎng)液中分離得到含有重組蘇氨酸脫氨酶的菌體細(xì)胞。6. -種權(quán)利要求1所述蘇氨酸脫水酶在催化L-蘇氨酸制備α- 丁酮酸中的應(yīng)用。7. 如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用以含蘇氨酸脫水酶基因的工程菌 經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體為催化劑，以L-蘇氨酸為底物，以pH值4. 0-10. 0的緩沖液為反 應(yīng)介質(zhì)，在15~50°C、150-200rpm條件下進行催化反應(yīng)，反應(yīng)完全后，將反應(yīng)液分離純化得 到α-丁酮酸。8. 如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述濕菌體的用量以緩沖液體積計為5~ 50g/L，所述底物用量以緩沖液體積計為100~600g/L。9. 如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述緩沖液為pH值7. 0的磷酸鈉緩沖液。10. 如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述反應(yīng)液分離純化的方法為：反應(yīng)結(jié)束 后，將反應(yīng)液離心，上清液減壓蒸餾至1/2體積，80°C保溫40min，離心，上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除 去水，取濃縮物得到α- 丁酮酸。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種蘇氨酸脫氨酶、編碼基因、載體、工程菌及應(yīng)用，本發(fā)明中所述α-丁酮酸的制備方法具有催化能力高底物累積可達600g/L以上，轉(zhuǎn)化率達95％以上、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好等優(yōu)點，在35℃條件下對L-蘇氨酸脫氨酶的酶活達到10156.5U/g，L-蘇氨酸的轉(zhuǎn)化率達到100％，為α-丁酮酸的大規(guī)模生產(chǎn)并為其作為前體的系列關(guān)鍵手性中間體提供了良好的技術(shù)支持，具有較高的工業(yè)化應(yīng)用潛力。
【IPC分類】C12N15/60, C12N1/21, C12N15/70, C12N9/88, C12P7/40
【公開號】CN105349516
【申請?zhí)枴緾N201510751632
【發(fā)明人】鄭裕國, 徐建妙, 柳志強, 胡海峰, 傅芳田
【申請人】浙江工業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年2月24日
【申請日】2015年11月6日