一種NT-proBNP核酸適配體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于NT-proBNP檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種NT-proBNP核酸適配體及其 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腦鈉肽（BNP)最早由Sudoh等在豬腦中發(fā)現(xiàn)，是一種由32氨基酸肽鏈組成的多肽 類神經(jīng)激素。人類心臟初始分泌的BNP是一種由132個氨基酸組成的前體，其后被酶切降 解為具有生物活性的BNP(32個氨基酸殘基組成）及腦鈉肽前體N末端（NT-ProBNP，76個 氨基酸殘基組成）。BNP和NT-ProBNP主要由心肌壁受壓后心室應(yīng)答釋放，是對心功能敏感 且特異的標志物，其在血液中的濃度與心功能障礙的嚴重程度相關(guān)，可以用來更客觀的評 價患者疾病的嚴重程度和患者的預(yù)后。廣泛應(yīng)用于心衰診斷、心衰預(yù)后與監(jiān)視的評估、急性 冠脈綜合癥的危險分類、早期或輕度的心功能不全等。
[0003] NT-ProBNP較BNP在評價心功能上更具有優(yōu)勢，其優(yōu)勢在于：l、NT-proBNP由76個 氨基酸組成，較BNP半衰期長，其半衰期大于lh，在血液中清除較慢，可累積較高濃度，更能 靈敏地反映心功能的狀態(tài)和變化，尤其是在早期診斷中；標本可以存放，即可以中心實驗室 檢測，也可以床邊檢測，BNP只能床邊即刻檢測；2、由于無生理活性，因而不受治療用合成 BNP的干擾；3、NT-proBNP可以使用血清和血漿，抗干擾性強，BNP只能使用血漿標本。4、 NT-proBNP的定量結(jié)果能提供可靠，且具有良好的重復(fù)性臨床信息，更適合臨床應(yīng)用。因此， 目前臨床應(yīng)用中已逐漸呈現(xiàn)將NT-proBNP取代BNP的趨勢。
[0004] 目前NT-proBNP檢測方法主要為免疫檢測方法，一種為競爭酶聯(lián)免疫分析，如 Biomedica Gruppe公司的產(chǎn)品；一種為雙抗體夾心法，如Roche Diagnostics的雙抗體夾 心化學發(fā)光法，已申報發(fā)明專利。目前，基于抗體的方法，有一定優(yōu)勢，但也有一些固有的缺 陷?，F(xiàn)在，科學家不約而同的把注意力聚焦到分子生物學新技術(shù)在生物檢測的應(yīng)用上。
[0005]SELEX技術(shù)（系統(tǒng)進化指數(shù)富集技術(shù)）是90年代初研制的一種新的組合化學技 術(shù)。其基本原理就是利用分子生物學技術(shù)，構(gòu)建人工合成的單鏈隨機寡核苷酸文庫，其中隨 機序列一般長度在20-40bp左右，文庫容量在1014-1015之間。由于單鏈隨機寡核苷酸片段 特別是RNA易形成發(fā)卡、口袋、假節(jié)、G-四聯(lián)體等二級結(jié)構(gòu)，故能與蛋白質(zhì)、小肽，甚至金屬 離子結(jié)合，形成具有很強結(jié)合力的復(fù)合物。這種方法具有簡便、快速、經(jīng)濟等特點，與其他組 合化學庫如隨機肽庫、抗體庫和噬菌體表面展示文庫相比，從寡核苷酸文庫中篩選出的核 酸適體具有許多優(yōu)勢：a.本身是寡核苷酸，分子量較小可以化學合成，節(jié)約成本；b.具有比 抗體更高的特異性和相近的親和性；c.便于標記，在不同部位有選擇性的標記；d.穩(wěn)定性 好，重復(fù)性好，易于保存，對高溫和劇烈條件不敏感。因此，寡核苷酸適配體在臨床檢測及診 斷中具有良好的應(yīng)用前景。有關(guān)核酸適配體檢測新技術(shù)已廣泛應(yīng)用生物檢測、生物傳感、體 內(nèi)成像、蛋白核酸功能研究各個領(lǐng)域，顯示出了誘人的前景。
[0006] NT-proBNP為76氨基酸殘基的多肽，分子量小，可利用的抗原表位局限，且被羅氏 專利保護，核酸適配體分子量只有10-20KD，較抗體IgG150kD小得多，在建立夾心法的檢測 中，可以獲得多個抗原位點的特異核酸適配體，可以克服抗體分子量大而引起空間位阻的 影響，易于夾心檢測方法的建立。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，其目的在于提供一種NT-proBNP核酸適配體及其 應(yīng)用。
[0008] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下；
[0009] 一種NT-proBNP核酸適配體，所述的核酸適配體為SEQ ID : 1-15所示的核苷酸序 列中的任意一條。
[0010] 所述的核酸適配體能與NT-proBNP蛋白或NT-proBNP蛋白N端氨基酸序列制備的 單克隆抗體相結(jié)合。
[0011]所述的NT-proBNP蛋白N端的氨基酸序列為GlySerAlaSerAspLeuGluThr SerGlyLeuGlnGluGlnArg。
[0012] 一種NT-proBNP核酸適配體在制備NT-proBNP檢測試劑盒中的應(yīng)用。
[0013] 所述的NT-proBNP核酸適配體被生物素標記。
[0014] 一種NT-proBNP核酸適配體在制備NT-proBNP檢測試紙條中的應(yīng)用。
[0015] 所述的NT-proBNP核酸適配體被膠體金標記。
[0016] 所述的NT-proBNP檢測試紙條的組成為：在PVC背襯（1)上依次粘附有樣品墊 (2)、結(jié)合墊（3)、硝酸纖維素膜（4)和吸水墊（5);所述的結(jié)合墊（3)上包被有由膠體金標 記的NT-proBNP核酸適配體；所述的硝酸纖維素膜設(shè)置有檢測線（6)和質(zhì)控線（7);其中， 檢測線（6)上包被有NT-proBNP蛋白N端氨基酸的單克隆抗體，質(zhì)控線（7)上包被有與膠 體金標記的NT-proBNP的核酸適配體結(jié)合的試劑。
[0017] 所述的與膠體金標記的NT-proBNP的核酸適配體結(jié)合的試劑為NT-proBNP核酸適 配體的互補序列。
[0018] 本發(fā)明的優(yōu)點為：所述的NT-proBNP核酸適配體本身是寡核苷酸，分子量較小， 可以化學合成，節(jié)約成本，具有比抗體更高的親和性和特異性；同時所述的NT-proBNP核 酸適配體便于標記，重復(fù)性和穩(wěn)定性好，易于保存。用所述NT-proBNP核酸適配體制備的 NT-proBNP檢測試劑盒和試紙條對NT-proBNP檢測靈敏，且易于優(yōu)化。
【附圖說明】
[0019] 圖1為合成的NT-proBNP基因與proBNP基因序列的測序比對圖。
[0020] 圖2為pGEX4T-1-NT-ProBNP表達載體的雙酶切電泳圖。
[0021] 圖3為純化后的GST-NT-proBNP蛋白的SDS-PAGE電泳圖；其中，1 :誘導(dǎo)前全菌，2 : 誘導(dǎo)沉淀，3 :誘導(dǎo)上清，4 :GST柱純化穿透液，5-9 :GST純化洗脫收集液，10 :蛋白分子量標 準。
[0022] 圖4為純化后的12G4單克隆抗體的SDS-PAGE電泳圖。
[0023] 圖5為陽性克隆PCR鑒定電泳圖。
[0024] 圖6為NT-proBNP核酸適配體活性評價柱形圖。
[0025] 圖7為一種NT-proBNP檢測試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實施方式】
[0026] 下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。
[0027] 實施例1 :全基因合成NT-proBNP基因，構(gòu)建pGEX4T-l-NT-ProBNP表達載體并純 化GST-NT-proBNP蛋白。
[0028] (1)通過genebank查詢proBNP基因序列，根據(jù)成熟BNP后剪切的N端序列即 NT-proBNP序列設(shè)計全序列合成方案，通過DNAwork2. 0軟件進行密碼子優(yōu)化，不改變氨基 酸序列組成，并使蛋白更易于在原核大腸桿菌中表達，然后在優(yōu)化后的核酸序列的兩端加 上EcoRI和SalI酶切位點，便于與表達載體連接克隆，優(yōu)化設(shè)計后的核苷酸序列如SEQ ID:16所示。將優(yōu)化后的序列送交金斯瑞公司進行合成，圖1為合成的NT-proBNP基因與 proBNP基因序列的測序比對圖。
[0029] (2)將合成基因NT-proBNP從PUC57載體中雙酶切后膠回收，并將pGex4T-l 載體雙酶切，回收載體片段，將回收基因片段和載體片段經(jīng)T4DNA連接酶連接，構(gòu)建成 pGEX4T-l-NT-Pr〇BNP表達載體，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，涂平板，37度培養(yǎng) 16h，挑取單克隆進行液體培養(yǎng)并提取質(zhì)粒進行雙酶切鑒定。圖2為pGEX4T-l-NT-Pr〇BNP 表達載體的雙酶切電泳圖，從圖可知表達載體構(gòu)建成功。
[0030] (3)將構(gòu)建好的pGEX4T-1-NT-ProBNP表達載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài) 細胞中，挑取單克隆進行IPTG誘導(dǎo)表達，挑選表達量高的單克隆保存作為菌種。放大菌種 培養(yǎng)，進行誘導(dǎo)后收集菌體，超聲破碎，采用GST標簽親和柱進行親和純化，收集洗脫峰進 行SDS-PAGE電泳分析，如圖3所示。純化的GST-NT-proBNP蛋白純度達95%以上，可以滿 足接下來的實驗需求。
[0031] 實施例2 :制備NT-proBNP蛋白N端氨基酸的單克隆抗體。
[0032] 分析NT-proBNP蛋白的抗原表位，選擇N端優(yōu)勢抗原表位，人共合成NT-proBNP蛋 白的N端 15 個氨基酸多肽(GlySerAlaSerAspLeuGluThrSerGlyLeuGlnGluGlnArg)，將合成 的多肽與牛血清白蛋白（BSA)共價偶聯(lián)后進行免疫，當血清效價達到要求后，進行脾細胞 分離，并與SP/20骨髓瘤細胞融合，進行單細胞克隆，將抗體效價高的單細胞克隆進行亞克 隆，如表1所示：5G4、5E7和12G4單克隆抗體活性較高，將此3株活性較高的單克隆抗體制 備腹水，并用proteinA親和層析進行純化。圖4為純化后的12G4單克隆抗體的SDS-PAGE 電泳圖，顯示為重鏈、輕鏈兩條帶。
[0033] 表1 :單克隆抗體的篩選（0D450nm吸光度）
[0034]
[0035] 實施例3:篩選與獲得的單克隆抗體配對的NT-proBNP核酸適配體。
[0036] 篩選步驟如下：
[0037] 1、硅包磁珠經(jīng)APTES(2% )氨基硅烷化處理，使其帶活性氨基，形成氨基磁珠；
[0038]2、將 8ug/ml的NT-proBNP單克隆抗體（5G4)，在 37°C下經(jīng)EDC/NHS(4mg/ml/llmg/ ml)活化羧基，活化時間為15min;然后取lml活化后的單克隆抗體與lmg氨基磁珠在37°C 下偶聯(lián)lh，形成偶聯(lián)抗體磁珠；
[0039] 3、用PBS清洗偶聯(lián)抗體磁珠5次，然后用1 %BSA封閉過夜；
[0040] 4、加入100ul(2mg/ml)的GST-NT-proBNP蛋白到lml的偶聯(lián)抗體磁珠中，孵育2h， 形成結(jié)合GST-NT-proBNP蛋白的偶聯(lián)抗體磁珠；
[0041] 5、用SHMCK(0. 2%Tween-20)洗 5 次；
[0042] 6、將人工合成的ssDNA文