食品和餐飲具中單增李斯特菌快速檢測(cè)冷水凝膠試紙片及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物安全檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速檢測(cè)紙片，更具體 地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種專門(mén)用于食品和餐飲具中快速檢測(cè)單增李斯特菌的定性和定量檢測(cè) 的冷水凝膠試紙片及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 單增李斯特菌分布較廣，單增李斯特菌是唯一能引起人類疾病的。單核增生李斯 特菌（Listeriamonocytogenes)是一種常見(jiàn)的土壤細(xì)菌，在土壤中它是一種腐生菌，以死 亡的和正在腐爛的有機(jī)物為食。它也是某些食物（主要是鮮奶產(chǎn)品）中的一種污染物，能 引起嚴(yán)重食物中毒。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌是一種人畜共患病的病原菌。它能引起人、 畜的李氏特菌病，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞增多。它廣泛存在于自然界 中，食品中存在的單增李氏菌對(duì)人類的安全具有危險(xiǎn)，該菌在4°C的環(huán)境中仍可生長(zhǎng)繁殖， 是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。單增李斯特菌是評(píng)價(jià)食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指 標(biāo)之一，目前已被國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用于食品衛(wèi)生工作中。我國(guó)已將其納入"國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)"。國(guó)標(biāo) 方法檢測(cè)單增李斯特菌需要配制新鮮培養(yǎng)基，操作方法繁瑣，成本較高，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，達(dá)不 到快速一步法檢測(cè)。因此，業(yè)內(nèi)一直希望能有一種經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、易行、快速、準(zhǔn)確的方法和產(chǎn) 品。
[0003] 紙片法是上世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的一種快速檢測(cè)食品及食品接觸的物體表面、 餐具、茶具中單增李斯特菌污染情況的方法。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)單增李斯特菌檢測(cè)研究較多， 基于分子生物學(xué)檢測(cè)方法，如PCR方法、LAMP法等；基于膠體金檢測(cè)法；基于ELISA檢測(cè)法； 特異性顯色培養(yǎng)法等。但上述方法需要特殊的檢測(cè)設(shè)備，不便于日?，F(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)需求。 申請(qǐng)?zhí)枮?01510274726. 9的專利申請(qǐng)公開(kāi)了一種"快速檢測(cè)單增李斯特菌的檢測(cè)試紙及 其制備和應(yīng)用"，該檢測(cè)試紙整體呈矩形，包括加樣區(qū)，底物區(qū)及顯色區(qū)三個(gè)功能區(qū)，相鄰兩 區(qū)之間設(shè)置著流體通道，在底物區(qū)邊界中設(shè)置著含有底物5-溴-4-氯-3-吲羥肌醇磷酸銨 X-InP的底物層，但是該現(xiàn)有技術(shù)中公開(kāi)的檢測(cè)試紙主要用于飲用水、肉食品、乳制品、蔬菜 中單增李斯特菌污染的定性檢測(cè)，不能用于餐飲具表面單增李斯特菌的檢測(cè)，且該檢測(cè)試 紙只能進(jìn)行定性檢測(cè)，無(wú)法滿足定量檢測(cè)需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服【背景技術(shù)】中所指出的問(wèn)題及現(xiàn)有技術(shù)存在的已有檢測(cè)產(chǎn)品和檢測(cè)方法 的不足，本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種專用于食品和餐飲具中快速檢測(cè)單增李斯特菌 并可定性、定量分析的冷水凝膠試紙片。該試紙片不僅適合于多種食品中單增李斯特菌的 檢測(cè)，也可用于餐飲具中單增李斯特菌的快速檢測(cè)。且該試紙片檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便易行、快 速準(zhǔn)確（一步法），特異性強(qiáng)，敏感性高，成本低廉，便于基層單位特別是邊沿地區(qū)及條件差 的基層試驗(yàn)室使用。另外，本發(fā)明還提供了一種上述所述冷水凝膠試紙片的制備方法與應(yīng) 用。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第一個(gè)目的，發(fā)明人通過(guò)大量試驗(yàn)研究和不懈探索，最終獲得 了如下技術(shù)方案：
[0006] -種單增李斯特菌快速檢測(cè)冷水凝膠試紙片，所述試紙片中含有混合培養(yǎng) 基，所述混合培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基、顯色劑和冷水凝膠組成，所述顯色劑的名稱為 (2R，3S，4R，5R，6R) -1，2, 3,4, 5-五羥基環(huán)己基-(2-硝基-4-氟苯基）磷酸酯，分子量為 398,所述顯色劑的結(jié)構(gòu)式如式一所示：
[0007]
[0008] 進(jìn)一步地，上述技術(shù)方案中所述的顯色劑（21?，33,41?，51?，61?)-1，2,3,4,5-五羥基 環(huán)己基-(2-硝基-4-氟苯基）磷酸酯采用如下方法制備而成，包括如下步驟：
[0009] (1)將反應(yīng)物A溶于無(wú)水二異丙胺及少量無(wú)水氯仿中，得到反應(yīng)物A體系，然后將 所述反應(yīng)物A體系置于-70~-80°C條件下冷凍；
[0010] (2)在低溫-70~-80°C低溫條件下，將反應(yīng)物B在無(wú)水、氮?dú)夥諊兄鸬渭尤氲?反應(yīng)物A體系中，劇烈攪拌，反應(yīng)5. 5~6. 5h;
[0011] (3)將步驟（2)反應(yīng)后的體系置于室溫環(huán)境中，待反應(yīng)體系達(dá)到室溫后，繼續(xù)向體 系中加入溶有反應(yīng)物C的無(wú)水氯仿溶液，室溫繼續(xù)攪拌反應(yīng)12~14h，生成亞磷酸酯類物 質(zhì)；
[0012] (4)在步驟（3)反應(yīng)后的體系中加入叔丁基過(guò)氧化氫，將亞磷酸鹽氧化，并將得到 的磷酸鹽置于三甲胺中，在50±0. 5°C條件下放置22~24h;
[0013] (5)除去三甲胺，得到粗產(chǎn)物后，再加入乙硫醇和三氟化硼-醚溶液進(jìn)行去保護(hù)反 應(yīng)，最終得到的目標(biāo)產(chǎn)物即為所述顯色劑，其中，所述反應(yīng)物A為1，2,3,4,5,6-六甲氧基亞 甲基-肌醇，反應(yīng)物B為二氯亞磷酸甲酯，反應(yīng)物C為2-硝基-4-氟苯酚。
[0014] 進(jìn)一步地，上述技術(shù)方案中所述反應(yīng)物A、反應(yīng)物B、反應(yīng)物C的用量摩爾比為 1:1. 25:2〇
[0015] 進(jìn)一步地，上述技術(shù)方案步驟（1)中所述反應(yīng)物A與無(wú)水二異丙胺的用量摩爾比 為 1:2. 5〇
[0016] 上述所述顯色劑在制備過(guò)程中發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)方程式如式二所示：
[0017]式二
[0018] 進(jìn)一步地，上述技術(shù)方案中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基由胰蛋白胨、牛肉粉、多價(jià)胨、氯化納、 磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、甘氨酸、氯化鋰、苯乙醇、七葉苷組成；所述冷水凝膠由聚丙烯酸 鈉、黃原膠和海藻糖組成。
[0019] 進(jìn)一步地，上述技術(shù)方案中每升所述混合培養(yǎng)基中含有胰蛋白胨5. 0~6.0g、牛 肉粉5. 0~6. 0g、多價(jià)胨3. 0~5. 0g、氯化納8.0~10. 0g、磷酸二氫鉀1. 0~1. 5g、磷酸 氫二鈉5. 0~7.Og、甘氨酸8. 0~10.Og、氯化鋰1. 0~2.Og、苯乙醇2. 0~3.Og、七葉苷 1· 0~1. 5g;顯色劑（2R，3S，4R，5R，6R) -1，2, 3,4, 5-五羥基環(huán)己基-(2-硝基-4-氟苯基） 磷酸酯2. 0~2. 5g;聚丙稀酸鈉4. 0~6.Og、黃原膠1. 0~3.Og、海藻糖2. 0~4.Og。
[0020] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種上述所述單增李斯特菌快速檢測(cè)冷水凝膠試紙 片制備方法，所述方法包括如下步驟：
[0021] (1)載體紙片制備：將層析濾紙剪切成5cmX5cm規(guī)格，經(jīng)輻照或高壓滅菌，高壓滅 菌后于50°C恒溫真空干燥后備用；
[0022] (2)內(nèi)包裝袋：將耐高溫的聚丙烯塑料薄膜袋，按試驗(yàn)要求壓合成5. 2cmX5. 2cm 規(guī)格的聯(lián)袋；
[0023] (3)基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制：每升混合培養(yǎng)基中含有胰蛋白胨5.0~6. 0g、牛肉粉5.0~ 6. 0g、多價(jià)胨3. 0~5. 0g、氯化納8. 0~10. 0g、磷酸二氫鉀1. 0~1. 5g、磷酸氫二鈉5. 0~ 7. 0g、甘氨酸8. 0~10. 0g、氯化鋰1. 0~2. 0g、苯乙醇2. 0~3. 0g、七葉苷1. 0~1. 5g;
[0024] (4)每升培養(yǎng)基中含有顯色劑（2R，3S，4R，5R，6R) -1，2, 3, 4, 5-五羥基環(huán)己 基-(2-硝基-4-氟苯基）磷酸酯2. 0~2. 5g;
[0025] (5)冷水凝膠配制：0·4~0·6%聚丙烯酸鈉、0·1~0·3%黃原膠和0·2~0·4% 海藻糖，所述百分比均為質(zhì)量體積百分比；
[0026] (6)混合培養(yǎng)基配制：將基礎(chǔ)培養(yǎng)基、顯色劑和冷水凝膠混合均勾，加去離子水定 容至1000ml，于115°C、高壓條件下滅菌15min，調(diào)節(jié)pH至7. 2~7. 4;
[0027] (7)試紙片制作：將滅菌載體紙片依次放入滅菌的燒杯中，加入40°C~45°C的混 合培養(yǎng)基使之淹沒(méi)紙片，浸泡8~10min，使培養(yǎng)基充分吸附于紙片，擺放于無(wú)菌不銹鋼絲 網(wǎng)上，45 °C恒溫真空干燥；
[0028] (8)試紙片包裝：將浸漬烘干的紙片，無(wú)菌操作裝入無(wú)菌的塑膜袋內(nèi)，其中 5cmX5cm的紙片，每袋1張，再裝入鋁鈾袋，封口后室溫以下保存?zhèn)溆谩?br>[0029] 本發(fā)明的還一目的在于提供上述所述的單增李斯特菌快速檢測(cè)冷水凝膠紙片的 應(yīng)用。
[0030] 如上所述的一種單增李斯特菌快速檢測(cè)冷水凝膠紙片，所述試紙片可同時(shí)適用于 食品和餐飲具中單增李斯特菌的定量、定性檢測(cè)。
[0031] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0032] 1、本發(fā)明適用于食品和餐飲具中單增李斯特菌定量和定性檢測(cè)分析，本發(fā)明利用 冷水凝膠以層析濾紙為載體，將培養(yǎng)基成分、顯色劑和冷水凝膠混合，均勻地負(fù)載到層析濾 紙上，樣品可均勻分布于冷水凝膠，在其表