一種bac末端測序的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種BAC末端測序的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著分子生物學技術(shù)和二代測序技術(shù)的發(fā)展和完善，目前的生物學研究已經(jīng)進入 高速發(fā)展階段，越來越多的生物基因組全序列測序相繼完成，人們對于重要功能基因的挖 掘速度也在逐步加快?；蚪M學研究逐步進入后基因組時代，即功能基因組學時代。研究 表明，一些重要性狀的功能基因往往成簇存在，并存在高級復雜結(jié)構(gòu)，因此在進行全基因組 測序時難以被測出，構(gòu)建細菌人工染色體文庫（BAC文庫）并進行目標BAC克隆的測序就成 為必要的補充。同時對于尚未完成基因組測序的生物，要想進行重要性狀及一些大片段復 雜性狀的功能基因研究和克隆，構(gòu)建BAC文庫并進行篩選、物理作圖和測序更是必然選擇。
[0003] 在BAC文庫基礎(chǔ)上可以開展大規(guī)模的物理作圖、基因組測序、基因定位與圖位克 隆、基因轉(zhuǎn)化、著絲粒結(jié)構(gòu)及進化、及比較基因組學等研究工作，這必然涉及到BAC文庫中 候選目標BAC克隆的末端測序。通過BAC末端測序確定BAC克隆插入片段兩端的序列，在 生物基因組全序列測序中能夠迅速而精確地進彳丁序列拼裝，并確定基因組序列結(jié)構(gòu)的多態(tài) 性，如倒置和易位等。因此，BAC末端測序在生物基因組特別是大型復雜基因組的序列組裝 中具有重要作用。
[0004] 2014年7月17日基于BAC文庫構(gòu)建，采用BAC-to-BAC測序策略，完成了Chinese Spring小麥品種的每個染色體臂的基因組序列，以及小麥染色體3B基因組序列的組裝，呈 遞了幾近完整的小麥基因組序列信息，該項研究成果發(fā)表在世界頂尖雜志Science上，并 為所剩下的20條染色體的測序組裝建立了一個模板和范本。應(yīng)用這一相同的策略，今年可 能會完成另外幾條普通小麥染色體的測序和組裝。
[0005]目前真核生物物理圖譜構(gòu)建的主要方法是重疊克隆群作圖法，應(yīng)用非常廣泛，通 常采用染色體步移來構(gòu)建克隆重疊群，染色體步移是先在BAC文庫中選擇某個克隆，通過 探針（如末端序列）篩選到與其重疊的下一個克隆，進而尋找到第三個克隆，而將克隆群延 伸。很多科研人員從BAC文庫中篩選出包含目標區(qū)域的BAC克隆，并對目標片段進行測序或 者利用BAC末端序列，在同源物種內(nèi)對同源區(qū)段進行比較分析型，系統(tǒng)地研究物種的進化、 馴化、基因組結(jié)構(gòu)、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。Vu等（2010)報道了一個BAC-HAPPYmapping的方法來 構(gòu)建物理圖。他們利用BAC末端測序信息準確搭橋BAC克隆結(jié)合二代測序技術(shù)高通量的優(yōu) 點達到操作簡單，成本低，速度快構(gòu)建圖譜。該方法在對復雜基因組的測序，作圖和拼裝方 面有廣闊的應(yīng)用前景。
[0006] 但由于BAC克隆的插入片段較大，在進行末端測序時，PCR所用熒光燃料Bigdye 的量較多，是普通小質(zhì)?；騊CR產(chǎn)物測序的3-5倍，而測序的主要成本就在所使用的熒光染 料上，因此，測序成本相當于普通測序的3-5倍，并且其測序的失敗率較高，導致國內(nèi)一些 測序公司的BAC末端測序成本居高不下，特別是進行少量BAC末端測序時，市場價格高達 60-80元人民幣/反應(yīng)，而普通測序則為16-20元人民幣/反應(yīng)。因此，建立像普通測序那 樣高效低成本的BAC末端測序方法具有重要而深遠的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的一個目的是提供一種目的片段的末端測序的方法。
[0008] 本發(fā)明提供的目的片段的末端測序的方法包括如下步驟：
[0009] 1)將目的片段與克隆載體連接，得到重組載體；
[0010] 2)用限制性內(nèi)切酶酶切所述重組載體，回收大于所述克隆載體的線性DNA片段， 得到含有目的片段2個末端的DNA片段；
[0011] 所述目的片段上至少含有2個所述限制性內(nèi)切酶的酶切識別位點，且在所述克隆 載體上沒有所述限制性內(nèi)切酶的酶切識別位點；
[0012] 3)連接所述含有目的片段2個末端的DNA片段，使其環(huán)化形成含有目的片段末端 的質(zhì)粒，測序所述質(zhì)粒，實現(xiàn)目的片段的末端測序。
[0013] 上述方法中，所述目的片段為大于70kb的DNA片段。
[0014] 上述方法中，所述含有目的片段2個末端的DNA片段為比所述克隆載體大0. 4-4kb 的DNA片段。
[0015] 上述方法中，所述克隆載體為λ噬菌體載體、P1噬菌體載體、粘粒載體、細菌人工 染色體或酵母人工染色體等可以承載插入大片段的載體。
[0016] 上述方法中，所述克隆載體為細菌人工染色體。
[0017] 上述方法中，所述細菌人工染色體為pCCIBAC載體或pIndigoBAC-5載體。
[0018] 上述方法中，步驟1)中，所述克隆載體為pCCIBAC載體，所述限制性內(nèi)切酶為Mlu I;步驟2)中，所述克隆載體為pCCIBAC載體，回收大小在8-12kb之間的DNA片段。
[0019] 上述方法中，步驟1)中，所述克隆載體為pIndigoBAC-5載體，所述限制性內(nèi)切酶 為ClaI;步驟2)中，所述克隆載體為pIndigoBAC-5載體，回收大小在7. 5-11. 5kb之間的 DNA片段。
[0020] 本發(fā)明提供了一種高效低成本的BAC末端測序方法，該方法可使BAC末端測序像 普通小質(zhì)粒測序一樣進行測序，并且進行大規(guī)模BAC末端測序時可以和二代測序進行有效 對接，大大提高效率，降低成本。通過實驗證明：本發(fā)明的方法實現(xiàn)BAC末端測序100%成 功，解決BAC末端測序成功率低的問題，不僅使BAC末端測序變得簡單易行，而且測序成本 低，對于單個BAC測序，成本約為原測序成本的20 %，可有效與二代測序技術(shù)相結(jié)合，特別 適合于大規(guī)模BAC末端測序。
【附圖說明】
[0021] 圖1為馬鈴薯合作88BAC克隆酶切后的電泳圖。M: 12KbMaker從上到下依次為 12Kb、llKb、10Kb、9Kb、8Kb、7Kb、6Kb、5Kb、4Kb、3Kb、2Kb;1:待測BAC末端質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物； 2:pCClBAC?(HindIIICloning-Ready)大小約為 8. 12kb。
[0022] 圖2為馬鈴薯合作88BAC末端測序結(jié)果圖。
[0023] 圖3為茶葉BAC克隆酶切后的電泳圖。M: 12KbMaker從上到下依次為12Kb、11Kb、 10Kb、9Kb、8Kb、7Kb、6Kb、5Kb、4Kb、3Kb、2Kb。l:pIndigoBAC-5Vector大小約為 7. 5kb;2:待 測茶葉BAC末端質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物。
[0024] 圖4為茶葉BAC末端測序結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0025] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0026] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0027] 下述實施例中的固體LB平板的配制方法：100mLLB+100μ1 200mg/mL IPTG+100μ1 20mg/mLX-gal+25μ1 50mg/mLCAM。
[0028]下述實施例中的溶液I:50mmol/L葡萄糖、25mmol/LTris.Cl(pH8. 0)、lOmmol/L EDTA(pH8. 0)，在 15psi(1.05kg/cm2)高壓下蒸氣滅菌 15 分鐘，存于 4°C。
[0029] 下述實施例中的溶液II:0· 2mol/LNaOH、1 % (W/V)SDS，需新鮮配制。
[0030] 下述實施例中的溶液III:3mol/L乙酸鉀、5mol/L冰乙酸，在101bf/ in2(6. 895X104Pa)高壓下蒸氣滅菌15分鐘，存于4°C。
[0031] 下述實施例中的馬鈴薯合作88在文獻"LiCH，WangJ，ChienDH，ChujoyE，Song BF,VanderZaagP.Cooperation-88:AHighYielding,Multi-Purpose,LateBlight ResistantCultivarGrowinginSouthwestChina.Am.J.PotRes. 2010.D0I10.1007/ sl2230-010-9174-z. "中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所獲得D
[0032] 實施例1、馬鈴薯合作88BAC質(zhì)粒末端測序
[0033] -、馬鈴薯合作88BAC質(zhì)粒文庫的制備
[0034] 本發(fā)明的馬鈴薯合作88BAC文庫由百博明創(chuàng)（北京）生物科技有限公司協(xié)助構(gòu) 建，文庫構(gòu)建所用的載體為pCClBAC?(HindIIICloning-Ready) (EPICENTRE)，載體的大小 為8. 12kb，BAC文庫中插入片段大小平均為80-150kb。
[0035] 二、BAC質(zhì)粒的提取
[0036] 1、挑取步驟一的馬鈴薯合作88BAC文庫中1個克?。ê刑囟ㄆ蔚腂AC質(zhì)粒） 于4mLLB培養(yǎng)基（含有氯霉素12. 5μg/mL)的試管中，置于37°C的搖床過夜培養(yǎng)（250rpm， 18h)，得到培養(yǎng)后的菌體。
[0037] 2、收集步驟1的培養(yǎng)后的菌體于2mL離心管，室溫12000rpm離心10分鐘，收集沉 淀，棄上清。
[0038] 3、用400μL溶液I重懸上述步驟2獲得的沉淀。
[0039] 4、向步驟3中加入新配制的400μL溶液II，上下顛倒數(shù)次，靜止10-15分鐘。
[0040] 5、向步驟4中加入400μL溶液III，上下顛倒數(shù)次，靜止10分鐘，室溫12000rpm離 心10min，取上清。
[0041] 6、將步驟5獲得的上清液（約1000μL)小心地轉(zhuǎn)移到一個干凈的微量離心管中， 并加入600μL冰冷的異丙醇，輕搖混勻，-20°C放置30min。
[0042] 7、將