大豆黃色相關基因分子標記及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種大豆黃色相關基因分子標記開發(fā)及其應用。
【背景技術】
[0002] 葉色變異是比較常見的突變性狀，一般在苗期表達，但少數(shù)突變體直到生育后期 才發(fā)生葉色突變。由于突變基因往往是直接或間接影響葉綠素的合成和降解，改變?nèi)~綠素 含量，所以葉色突變體也稱為葉綠素突變體。葉色變異通常影響突變體光合效率，造成作物 減產(chǎn)，嚴重時甚至導致植株死亡，因此過去常被認為是無意義的突變。近年來，葉色突變體 的利用價值受到越來越多關注。在育種工作中，葉色變異可作為標記性狀，簡化良種繁育和 雜交種生產(chǎn)；植株可為作物遺傳育種提供優(yōu)良種質(zhì)資源。
[0003] 在基礎研究中，顏色改變是研究植物光合作用、光形態(tài)建成、激素生理以及抗病機 制等一系列生理代謝過程的理想材料；同時顏色突變體可用于分析鑒定基因功能，了解基 因互作。因而，研究大豆黃化突變體不僅有理論意義，同時還有重要的實際應用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種大豆黃色相關基因分子標記的開發(fā)及其應用。
[0005] 本發(fā)明所提供的應用具體為大豆基因組中Glymal3g30560基因（Glycinemax Wm82.a2.vl，下同）第1727位核苷酸的單核苷酸多態(tài)性在鑒定大豆黃色突變體中的應用； 所述單核苷酸多態(tài)性是指所述大豆基因組中Glymal3g30560基因的第1727位核苷酸為G 或A。
[0006] 當然，用于鑒定大豆基因組中Glymal3g30560基因的第1727位核苷酸為G還是A 的物質(zhì)在鑒定大豆黃色突變體的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0007] 在所述應用中，所述用于鑒定大豆基因組中Glymal3g30560基因的第1727位核苷 酸為G還是A的物質(zhì)包括且不限于本發(fā)明的引物對；所述引物對中的上游引物根據(jù)所述大 豆基因組中Glymal3g30560基因的第1727位核苷酸的上游序列進行設計，所述引物對中的 下游引物根據(jù)所述大豆基因組中Glymal3g30560基因的第1727位核苷酸的下游序列進行 設計。
[0008] 所述用于鑒定大豆基因組中Glymal3g30560基因的第1727位核苷酸為G還是A 的物質(zhì)除了包括且不限于本發(fā)明的引物對外，還包括與所述引物對相互配合使用的限制性 內(nèi)切酶以及其它檢測方法。
[0009] 在本發(fā)明中，所述用于鑒定大豆基因組中Glymal3g30560基因的第1727位核苷酸 為G還是A的物質(zhì)為如下（a)或（b)或（c):
[0010] (a)引物對A;
[0011] (b)所述引物對A和引物對B;
[0012] (c)所述引物對A、所述引物對B和限制性內(nèi)切酶MboII;
[0013] 所述引物對A為由序列表中序列4所示的單鏈DNA和序列5所示的單鏈DNA組成 的引物對；所述引物對B為由序列表中序列6所示的單鏈DNA和序列7所示的單鏈DNA組 成的引物對。
[0014] 本發(fā)明還提供了用于鑒定大豆黃化突變體和/或鑒定待測大豆基因組中 Glymal3g30560基因的第1727位核苷酸為G還是A的引物對、成套引物以及試劑盒。
[0015] 本發(fā)明所提供的用于鑒定大豆黃色突變體的引物對，具體為序列表中序列4和序 列5所示單鏈DNA組成的引物對。
[0016] 在實際應用中，所述引物對中的兩條單鏈DNA在PCR反應體系中的摩爾比可為1 : 1〇
[0017] 本發(fā)明所提供的用于鑒定大豆黃色突變體的成套引物對，具體由如下引物對A和 引物對B組成：所述引物對A為由序列表中序列4所示的單鏈DNA和序列5所示的單鏈DNA 組成的引物對；所述引物對B為由序列表中序列6所示的單鏈DNA和序列7所示的單鏈DNA 組成的引物對。
[0018] 本發(fā)明所提供的用于鑒定大豆黃色突變體的試劑盒，含有如下引物對A、引物對B 和限制性內(nèi)切酶MboII:所述引物對A為由序列表中序列4所示的單鏈DNA和序列5所示 的單鏈DNA組成的引物對；所述引物對B為由序列表中序列6所示的單鏈DNA和序列7所 示的單鏈DNA組成的引物對。
[0019] 所述引物對或所述成套引物對或所述試劑盒在鑒定待測大豆基因組中 Glymal3g30560基因的第1727位核苷酸為G還是A中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。 [0020] 本發(fā)明還提供了一種鑒定或輔助鑒定待測大豆是否為大豆黃色突變體的方法。
[0021] 本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定待測大豆是否為大豆黃色突變體的方法，具體可 包括如下步驟：檢測待測大豆的基因組中Glymal3g30560基因的第1727位核苷酸為A還是 G還是A和G，根據(jù)檢測結果按照如下確定所述待測大豆是否為大豆黃色突變體：若所述待 測大豆的基因組中Glymal3g30560基因的第1727位核苷酸為A，則所述待測大豆為或候選 為大豆黃色突變體；若所述待測大豆的基因組中Glymal3g30560基因的第1727位核苷酸為 G或者為A和G，則所述待測大豆不為或候選不為大豆黃色突變體。
[0022] 更加具體的，本發(fā)明所提供的方法可為如下（A)-(C)中任一種：
[0023] ⑷包括：
[0024] (A1)以待測大豆的基因組DNA為模板，采用所述引物對A(序列4和序列5)進行 PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物；
[0025] (A2)對步驟（A1)所得的PCR產(chǎn)物進行測序，根據(jù)測序結果按照如下方法確定所述 待測大豆的是否為大豆黃色突變體：若所述PCR產(chǎn)物的序列為序列表中序列2,第644位核 苷酸為A，則所述待測大豆為或候選為大豆黃色突變體；若所述PCR產(chǎn)物的序列為序列表中 序列2,第644位核苷酸為G或為G與A的疊加（所述G與A的疊加是由于所述待測大豆為 雜合，測序圖上該位點呈現(xiàn)G與A的疊加峰），則所述待測大豆不為或候選不為大豆黃色突 變體（即為或候選為野生型大豆）；
[0026] (B)包括：
[0027] (B1)以待測大豆的基因組DNA為模板，采用所述引物對A(序列4和序列5)進行 PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物1 ;再以所述PCR產(chǎn)物1為模板，采用所述引物對B(序列6和序列 7)進行PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物2 ;
[0028] (B2)對步驟（B1)所得的PCR產(chǎn)物2進行測序，根據(jù)測序結果按照如下方法確定所 述待測大豆的是否為大豆黃色突變體：若所述PCR產(chǎn)物2的序列為序列表中序列3,第242 位核苷酸為A，則所述待測大豆為或候選為大豆黃色突變體；若所述PCR產(chǎn)物2的序列為序 列表中序列3,第242位核苷酸為G或為G與A的疊加（所述G與A的疊加是由于所述待測 大豆為雜合，測序圖上該位點呈現(xiàn)G與A的疊加峰），則所述待測大豆不為或候選不為大豆 黃色突變體（即為或候選為野生型大豆）；
[0029] (C)包括：
[0030] (C1)以待測大豆的基因組DNA為模板，采用所述引物對A(序列4和序列5)進行PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物1 ;以所述PCR產(chǎn)物1為模板，采用所述引物對B(序列6和序列7) 進行PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物2 ;再采用所述限制性內(nèi)切酶MboII對所述PCR產(chǎn)物2進行酶 切，得到酶切產(chǎn)物；
[0031] (C2)根據(jù)步驟（C1)所得的酶切產(chǎn)物，按照如下方法確定所述待測大豆的是否為 大豆黃色突變體：若所述酶切產(chǎn)物僅為320bp的DNA片段，則所述待測大豆為或候選為大豆 黃色突變體；若所述酶切產(chǎn)物為254bp和66bp的兩個DNA片段，或為254bp、66bp和320bp 的三個DNA片段（由于所述待測大豆為雜合，因此所述PCR產(chǎn)物2既有不能被所述限制性 內(nèi)切酶MboII切開的DNA片段，也有可以被所述限制性內(nèi)切酶MboII切開的DNA片段），則 所述待測大豆不為或候選不為大豆黃色突變體（即為或候選為野生型大豆）。
[0032] 在所述（C2)中，所述320bp的DNA片段具體為序列表中序列3所示DNA片段，第 242位核苷酸為A。所述254bp和66bp的兩個DNA片段分別為序列表中序列3的第1-254 位所示DNA片段以及序列表中序列3的第255-320位所示DNA片段，所述序列表中序列3 的第1-254位所示DNA片段中對應序列3的第242位的核苷酸為G。
[0033] 在本發(fā)明中，所述Glymal3g30560基因（大豆基因組中的Glymal3g30560基因） 的核苷酸序列具體為序列表中序列1。
[0034] 所述大豆黃色突變體為由于大豆基因組中所述Glymal3g30560基因的第1727位 核苷酸發(fā)生由G到A的純合突變所造成的植株黃色突變體。
[0035]