一種鑒定砂梨品種抗黑斑病的ssr分子標(biāo)記方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于果樹分子遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種鑒定砂梨品種抗黑斑病的 SSR分子標(biāo)記方法，可用于砂梨品種抗黑斑病早期鑒定和砂梨抗黑斑病育種，以提高砂梨抗 病育種效率，適用于從事梨科研、育種及生產(chǎn)的科研單位和公司。
【背景技術(shù)】
[0002] 梨是世界上重要的水果之一，它已經(jīng)在世界范圍內(nèi)50個國家進(jìn)行很長時間的商 業(yè)化栽培。但梨樹病害是制約梨產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個重要因素。由互隔交鏈孢菌 引起的梨黑斑病是砂梨重要的病害之一。梨黑斑病主要危害梨樹葉片、果實和 新梢。葉部受害，幼葉先發(fā)病、褐色或黑褐色圓形斑點，后逐漸擴(kuò)大，形成近圓形或不規(guī)則形 病斑，病葉即焦枯、畸形，引起早期脫落。果實受害，果面出現(xiàn)一個至數(shù)個黑色斑點，逐漸擴(kuò) 大，顏色變淺，形成淺褐至灰褐色圓形病斑，略凹陷。發(fā)病后期病果畸形、龜裂，裂縫可深達(dá) 果心，果面和裂縫內(nèi)產(chǎn)生黑霉，并常常引起落果。果實近成熟期染病，前期表現(xiàn)與幼果相似， 但病斑較大，黑褐色，后期果肉軟腐而脫落。梨黑斑病的潛伏侵染能夠引起梨果在貯藏期的 腐爛，因此在梨的進(jìn)出口貿(mào)易中受到進(jìn)口國的嚴(yán)密關(guān)注。
[0003] 梨黑斑病防治不當(dāng)造成梨樹葉片提前脫落，容易使梨樹形成二次花，嚴(yán)重影響次 年梨果產(chǎn)量，給梨農(nóng)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前防治梨黑斑病的方法是使用甲基托布津、代 森錳鋅和苯醚甲環(huán)唑等化學(xué)藥劑，長期使用這些化學(xué)藥劑，必然會引起病原菌對化學(xué)藥劑 產(chǎn)生抗藥性、污染環(huán)境和對人體健康產(chǎn)生危害等問題。
[0004] 植物抗病育種是一種有效經(jīng)濟(jì)的防治病害的手段，由于梨樹的童期長，遺傳背景 復(fù)雜等造成傳統(tǒng)的抗病育種效率較低，而采用分子育種則可以避開童期的干擾，向現(xiàn)有栽 培品種引入抗病基因（R-gene)的同時，不會形成基因的大規(guī)模重組。抗病基因在分析植物 抗病機(jī)理中具有重要作用，一大批的抗病基因在水稻、小麥、大豆、蘋果和葡萄等植物中被 分離出來。近年來梨科研工作者已經(jīng)從梨中分離出梨火疫病、瘡痂病等抗病相關(guān)的抗病基 因，但目前還沒有梨黑斑病相關(guān)的抗病基因被分離克隆出來。轉(zhuǎn)錄組測序分析能夠在基因 表達(dá)水平反映植物在生長發(fā)育或由外界環(huán)境誘導(dǎo)所產(chǎn)生的變化，最新的雙末端測序技術(shù)能 夠提高DNA的測序效率和提高測序片段的長度，提供更好的轉(zhuǎn)錄組分析?；蛩降谋磉_(dá)、 基因表達(dá)的功能注釋、新基因的挖掘、SSR篩選和SNP的發(fā)現(xiàn)等轉(zhuǎn)錄組信息利用生物信息學(xué) 手段進(jìn)行研究，以便更好深入了解生物進(jìn)程。這些信息有助于預(yù)測單個基因的作用，也能闡 述更為復(fù)雜的信號途徑和揭示潛在的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。
[0005] 多年來，我們一直圍繞確定鑒定砂梨品種抗黑斑病的SSR分子標(biāo)記的分離工作進(jìn) 行研究，利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，通過對抗梨黑斑病種質(zhì)和感梨黑斑病的種質(zhì)的接種后的差 異表達(dá)基因的分析，篩選鑒定砂梨品種抗梨黑斑病的SSR分子標(biāo)記。本研究為砂梨品種抗 黑斑病早期鑒定和砂梨抗黑斑病分子育種奠定理論基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對梨樹的童期長，遺傳背景復(fù)雜等造成傳統(tǒng)的抗病育種效率較 低的問題，提供鑒定砂梨品種抗梨黑斑病的SSR分子標(biāo)記分子標(biāo)記，以提高砂梨品種抗黑 斑病早期鑒定和砂梨抗黑斑病育種的效率。
[0007] 為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施： 本發(fā)明是通過對高抗黑斑病梨品種"金晶梨"和高感黑斑病梨品種"紅粉梨"離體葉 片接種病原和無菌水后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，獲取響應(yīng)病菌誘導(dǎo)和品種之間的差異表達(dá)基 因，再通過差異基因的基因序列，篩選SSR位點，并根據(jù)SSR位點序列設(shè)計SSR引物，通過對 抗病梨品種"金晶梨"和感病品種"紅粉梨"的PCR擴(kuò)增來確定鑒定砂梨品種抗梨黑斑病的 SSR分子標(biāo)記。
[0008] 1. -種鑒定砂梨品種抗黑斑病的SSR分子標(biāo)記，其特征在于，包括如下步驟： A、 梨黑斑病接種 利用梨黑斑病菌株對高抗黑斑病梨品種"金晶梨"和高感黑斑病梨品種"紅粉梨"的葉 片進(jìn)行室內(nèi)接種，以噴霧無菌水作為對照；接種后分別在0天，1天，2天，3天和4天進(jìn)行 取樣，提取RNA; B、 上機(jī)測序RNA樣品制備 每個處理樣品的RNA使用TRIzol方法進(jìn)行提取，RNA的純度檢測使用Nanodrop分光 光度計進(jìn)行檢測；先將每個處理樣品的RNA濃度都稀釋到750ng/μ1，然后將0天，1天，2 天，3天和4天的RNA分別取40μ1混合成200μ1RNA混合液，得到四個處理的RNA樣品； 用帶有Oligo的磁珠富集真核生物的mRNA; 加入fragmentationbuffer將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模版，用random hexamers合成第一條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNaseΗ和DNApolymeraseI合成 第二條cDNA鏈，在經(jīng)過QiaQuickPCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫之后做末端修復(fù)、3' 加polyA并連接測序接頭，然后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 建好的文庫用IlluminaHiSeqTM2000進(jìn)行測序； C、 測序序列組裝及差異表達(dá)基因分析 利用已發(fā)表梨基因組作為參照基因組，使用快速拼接程序Bowtie對測序片段進(jìn)行組 裝，原始的基因表達(dá)數(shù)據(jù)使用RPKM進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化計算； 為了比較處理與對照樣品的差異基因，篩選差異顯著性P-valUe〈0. 005、錯誤率FDR彡0. 01且倍數(shù)差異在2倍以上的做為差異表達(dá)基因（DEGs); D、 抗黑斑病緊密相關(guān)基因的篩選 使用EBSeq軟件檢測4個樣品中的差異表達(dá)基因（DEGs); "紅粉梨"接種菌株與"紅粉梨"接種清水樣品比較獲得差異表達(dá)基因，"金晶梨"接種 菌株與"金晶梨"接種清水樣品比較獲得差異表達(dá)基因；比較來自"紅粉梨"與來自"金 晶梨"之間的差異表達(dá)基因，獲得了抗黑斑病緊密相關(guān)基因DEGs; E、 抗黑斑病緊密相關(guān)SSR位點篩選 基于上述篩選的抗黑斑病緊密相關(guān)基因DEGs，利用MIcroSAtellite(MISA)軟件篩選 出SSR位點； F、 砂梨抗黑斑病緊密相關(guān)的SSR分子標(biāo)記篩選 基于上述SSR位點，利用引物設(shè)計軟件Primer3進(jìn)行引物設(shè)計，每個SSR位點設(shè)計2對 引物；然后利用設(shè)計的SSR引物對"紅粉梨"和"金晶梨"的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，篩選出引物能夠 區(qū)分高抗黑斑病梨品種"金晶梨"和高感黑斑病梨品種"紅粉梨"（如表1)。
[0009] 上述的砂梨抗黑斑病的SSR分子標(biāo)記在梨樹育種上的應(yīng)用。
[0010] 使用上述方法可以確定鑒定砂梨品種抗黑斑病的SSR分子標(biāo)記，以提高砂梨抗黑 斑病育種的效率，為砂梨抗黑斑病分子育種和抗黑斑病機(jī)理的研究奠定理論基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0011] 圖1 "紅粉梨"與"金晶梨"接種梨黑斑病的發(fā)病癥狀； 圖2 "紅粉梨"與"金晶梨"樣品間比較獲得差異表達(dá)基因分析的韋恩氏圖； 圖3 "紅粉梨"與"金晶梨"基于11對SSR引物擴(kuò)增的電泳圖。
【具體實施方式】
[0012] 一種鑒定砂梨品種抗黑斑病的SSR分子標(biāo)記，是通過下列步驟獲得： 1、梨黑斑病接種 利用梨黑斑病菌株對高抗黑斑病梨品種"金晶梨"和高感黑斑病梨品種"紅粉梨"的葉 片進(jìn)行室內(nèi)接種，以噴霧無菌水作為對照。接種后分別在0天，1天，2天，3天和4天進(jìn)行取 樣，提取RNA。
[0013] 2、上機(jī)測序RNA樣品制備 每個處理樣品的RNA使用TRIzol方法進(jìn)行提取，RNA的純度檢測使用Nanodrop分光 光度計進(jìn)行檢測。先將每個處理樣品的RNA濃度都稀釋到750ng/μ1，然后將0天，1天，2 天，3天和4天的RNA分別取40μ1混合成200μ1RNA混合液，得到四個處理的RNA樣品。 用帶有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物的mRNA(若為原核生物，則用試劑盒去除rRNA后進(jìn) 入下一步)。加入fragmentationbuffer將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模版，用random hexamers(六堿基隨機(jī)引物）合成第一條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNaseΗ和DNA polymeraseI合成第二條cDNA鏈，在經(jīng)過QiaQuickPCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫之 后做末端修復(fù)、3'加polyA并連接測序接頭，然后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇，最 后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建好的文庫用IlluminaHiSeqTM2000進(jìn)行測序。
[0014] 3、測序序列組裝及差異表達(dá)基因分析 利用已發(fā)表梨基因組作為參照基因組，使用快速拼接程序Bowtie對測序片段進(jìn)行組 裝，原始的基因表達(dá)數(shù)據(jù)使用RPKM進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化計算。為了比較處理與對照樣品的差異基 因，篩選差異顯著性P-value〈0.005、錯誤率FDR< 0. 01且倍數(shù)差異在2倍以上的做為差異 表達(dá)基因（DEGs)。
[0015] 4、抗黑斑病緊密相關(guān)基因的篩選 使用EBSeq軟件（版本1. 1. 3)檢測4個樣品中的差異表達(dá)基因（DEGs)。"紅粉梨"接 種菌株與"紅粉梨"接種清水樣品比較獲得909個DEGs，"金晶梨"接種菌株與"金晶梨"接 種清水樣品比較獲得501個DEGs;比較來自"紅粉梨"與來自"金晶梨"之間的差異表達(dá)基 因，獲得了 152個抗黑斑病緊密相關(guān)基因DEGs。
[0016] 5、抗黑斑病緊密相關(guān)SSR位點篩選 基于上述篩選的152個抗黑斑病緊密相關(guān)基因DEGs，利用MIcroSAtellite(MISA)軟 件篩選出34個SSR位點。
[0017] 6、確定鑒定砂梨品種抗黑斑病的SSR分子標(biāo)記 基于34個SSR位點，利用引物設(shè)計軟件Primerf進(jìn)行引物設(shè)計，每個SSR位點設(shè)計2 對