治療和/或預(yù)防1型糖尿病的方法和組合物的制作方法
【專利說明】
[0001] 優(yōu)先權(quán)要求
[0002] 本申請要求2013年3月8日提交的美國臨時專利申請系列號61/775, 115的優(yōu)先 權(quán)，其全部內(nèi)容通過引用和參考并入本文。
[0003] 關(guān)于聯(lián)邦咨助研究的聲明
[0004] 本工作受來自美國政府通過國立衛(wèi)生研究院資助的資助號R56-AI-095235的支 持。美國政府享有本發(fā)明的某些權(quán)利。
技術(shù)領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明一般地涉及治療或預(yù)防1型糖尿病（"T1D"）的方法和組合物。
【背景技術(shù)】
[0006] 1型糖尿?。═1D)，曾經(jīng)稱為青少年糖尿病，是自身免疫介導(dǎo)的疾病，其特異 性靶向胰腺β細(xì)胞（Castano等，Ann.Rev.Immunol. 8:647-680 (1990))。疾病發(fā)病機(jī) 理涉及T細(xì)胞浸潤至胰島，其導(dǎo)致隨后產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞的破壞（Bach，Endroc. Rev. 15:516-542(1994))。沒有胰島素，不能儲存血糖（葡萄糖）并且稍后用作能量（Bach， Endroc.Rev. 15:516-542(1994))。T1D的早期癥狀包括尿頻、過度疲勞和興奮（VanBelle 等，Physiol.Rev. 91:79-118(2011))。延長暴露于血流中的高水平的葡萄糖可造成對整 個身體器官系統(tǒng)的嚴(yán)重?fù)p傷（Bach，Endroc.Rev. 15:516-542(1994))。不清楚T1D的準(zhǔn) 確原因，但是懷疑自身免疫、遺傳和環(huán)境因素（Tisch等，Cell. 85:291-297(1996))。世界 上大概三百萬人遭受T1D，一百萬是美國人，報道的增加速度是每年3至5%范圍的增加 (Melmed等，WilliamsTextbookofEndocrinology:第 12版（2011))。盡管該疾病的高 發(fā)病率，但是糖尿病仍不能治愈。受T1D折磨的人必須求助于膳食改變，持續(xù)監(jiān)測他們的血 糖水平和胰島素注射或通過栗持續(xù)胰島素注入（Freeborn等，J.Clin.Nurs.doi:10. 1111/ jocn. 120462013))。即使短時間血糖水平處理不當(dāng)可造成嚴(yán)重的后果，包括：腎衰竭、視力 改變、心臟病、中風(fēng)或甚至死亡（Simone等，DiabetesCare.22(Suppl.2):B7_B15(1999); Livingstone等，PLoSMed。9(10) :el001321 (2012);Secrest等，Diabetes Care. 33:2573-2579(2010))〇
[0007] 就許多自身免疫性疾病，T1D可能涉及多個自體抗原和不同的T細(xì)胞特異性 (Bach，Endroc.Rev. 15:516-542 (1994).;Tisch等，Cell. 85:291-297 (1996))?；蛐揎?以表達(dá)自身和改變的自身肽（Ig-嵌合體）的免疫球蛋白（"Igs"）可用于抑制病理學(xué)免 疫應(yīng)答（Miller等，Nat.Rev.Immunol. 7:665-677(2007))。這些Ig-嵌合體已經(jīng)顯不，由 于Ig-嵌合體的內(nèi)化、在內(nèi)體隔間中加工和肽對新合成的MHC分子的無限獲取，對T細(xì)胞的 呈遞相對于游離肽增加了 100 倍（Zaghouani等，Science. 259:224-227(1993);Legge等， J.Exp.Med. 185:1043-1053 (1997);Brumeanu等，J.Exp.Med. 178:1795-1799 (1993))。因為 Igs是自分子，即使當(dāng)需要重復(fù)注射時副作用最小，并且因此有助持續(xù)療法。Ig_嵌合體允 許特異性阻斷自活性免疫細(xì)胞的有害作用，同時保持身體的免疫系統(tǒng)清理外源抗原的能力 (Miller等，Nat.Rev.Immunol. 7:665-677(2007))。所以，表達(dá)致糖尿病肽的Ig-嵌合體是 吸引人的治療或預(yù)防T1D的抗原特異性治療方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本公開提供了在需要其的對象中治療或預(yù)防1型糖尿?。?T1D"）的方法和組合 物。在一個方面中，本公開提供了遞送抗原特異性療法用于下調(diào)致糖尿病T細(xì)胞（免疫調(diào) 節(jié)）和同時施用干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞用于在胰島中再生內(nèi)皮細(xì)胞用于治療或預(yù)防T1D的方 法。
[0009] 本公開提供了在需要其的對象中治療或預(yù)防糖尿病的方法，方法包括：向?qū)ο笫?用治療有效量的包括一定量的一個或多個干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞和一定量的至少一種抗原 特異性療法的組合物。
[0010] 本公開也提供了組合物，其以治療有效量包括一定量的一個或多個干細(xì)胞和/或 祖細(xì)胞和一定量的至少一種抗原特異性療法。
[0011] 本公開也提供了以治療有效量包括一定量的一個或多個干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞和 一定量的至少一種抗原特異性療法的組合物，以維持β-細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞形成和逆轉(zhuǎn)糖尿 病。
[0012] 本公開也提供了在需要其的對象中治療或預(yù)防糖尿病的方法，方法包括：向?qū)ο?施用治療有效量的包括一定量的純化骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞和免疫球蛋白Ig-GAD2的組合物。
[0013] 在任何上述方法或組合物的實施方式中，糖尿病是1型糖尿病。
[0014] 在任何上述方法或組合物的實施方式中，對象是哺乳動物包括，例如，人。
[0015] 在任何上述方法或組合物的實施方式中，干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞是全能的、多能的、 多功能的或單能的。
[0016] 在任何上述方法或組合物的實施方式中，干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞分離自骨髓。
[0017] 在任何上述方法或組合物的實施方式中，干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞是純化的骨髓內(nèi)皮 祖細(xì)胞。
[0018] 在任何上述方法或組合物的實施方式中，干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞是同種異體細(xì)胞。
[0019] 在任何上述方法或組合物的實施方式中，干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞是自體細(xì)胞。
[0020] 在任何上述方法或組合物的實施方式中，至少一種抗原特異性療法是免疫球蛋 白-多肽嵌合體。
[0021] 在任何上述方法或組合物的實施方式中，免疫球蛋白-多肽嵌合體是可溶的。
[0022] 在任何上述方法或組合物的實施方式中，免疫球蛋白-多肽嵌合體是聚集的。
[0023] 在任何上述方法或組合物的實施方式中，免疫球蛋白-多肽嵌合體包括具有CDR3 區(qū)域的免疫球蛋白，和其中致糖尿病抗原決定部位插在CDR3區(qū)域中。
[0024] 在任何上述方法或組合物的實施方式中，致糖尿病抗原決定部位源自GAD，例如包 括GAD2(SEQIDN0:1)或GAD1(SEQIDN0:2)。
[0025]在任何上述方法或組合物的實施方式中，致糖尿病抗原決定部位源自INSβ，例 如，包括INS0(SEQIDΝ0:3)。
【附圖說明】
[0026] 當(dāng)結(jié)合附圖閱讀時，將更好理解本公開的前述內(nèi)容，以及下述詳細(xì)說明。為了圖解 本公開的目的，圖中顯示了顯示了目前優(yōu)選的實施方式。但是，應(yīng)理解，本公開不限于顯示 的精確布置、實施例和手段。
[0027] 圖1A-D顯示單獨Ig_GAD2治療不能克服明顯T1D，盡管誘導(dǎo)免疫耐受。圖1A顯示 在用Ig-GAD2治療的明顯糖尿病小鼠中沒有恢復(fù)血糖量正常。下圖指示，在Ig-GAD2治療 的糖尿病小鼠中，盡管Ig_GAD2不能恢復(fù)血糖量正常，但是治療導(dǎo)致如脾中根除Thl7細(xì)胞 但是Thl細(xì)胞駐留顯示的致誘導(dǎo)免疫耐受，和IFNγ和/或IL-10的增加（圖1B-D)。
[0028] 圖2Α-Ε顯示在用Ig_GAD2和骨髓（ΒΜ)移植治療的明顯糖尿病小鼠中恢復(fù)血糖量 正常。圖2A描繪了治療方案的示意性表示。圖2B顯示與單獨接收BM或Ig-GAD2的小鼠 相比，在接收Ig-GAD2+BM的組合治療之后，維持血糖量正常的小鼠的百分?jǐn)?shù)增加。圖2C顯 示在接收Ig_GAD2+BM的小鼠的脾和胰腺細(xì)胞中產(chǎn)生的細(xì)胞因子的增加。圖2D顯示在脾和 胰腺的細(xì)胞中產(chǎn)生的IL-17的下降。圖2E顯示Thl和Thl7細(xì)胞的簽名轉(zhuǎn)錄因子的下降。
[0029] 圖3A-G顯示Ig_GAD2+BM接受小鼠中胰腺β-細(xì)胞的再生。圖3A-D顯示在 Ig-GAD2+BM治療的小鼠接受者中相比單獨Ig-GAD2或ΒΜ治療，血糖量正常的持續(xù)恢復(fù)。 Ig-GAD2+BM治療的小鼠接受者具有更多的胰島和更多的β-細(xì)胞，所述胰島大部分沒有胰 島炎，其具有最小滲透和豐富胰島素陽性細(xì)胞（圖3B-C。而且，用Ig-GAD2+BM的治療恢復(fù) 產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞和β-細(xì)胞群的數(shù)量（圖3E-G)。
[0030] 圖4A-D顯示從健康至高血糖至糖尿病的講展期間，在外周血液和腠腺中表達(dá) PECAM1的內(nèi)皮細(xì)胞的下降。
[0031] 圖5A-C顯示內(nèi)皮細(xì)胞的恢復(fù)與β-細(xì)胞再生平行。圖5Α顯示與單獨接收Ig-GAD2 或ΒΜ的那些小鼠相比，來自用Ig-GAD2+BM治療的小鼠的胰腺胰島切片中增加的PECAM1和 胰島素染色。圖5B顯示相對于未治療的糖尿病小鼠，接收Ig-GAD2+BM的小鼠中內(nèi)皮細(xì)胞 的功能標(biāo)記物的增加。來自Ig_GAD2+BM治療的小鼠的胰腺切片顯示和增加數(shù)量的胰島素 +ki-67+胰腺細(xì)胞（圖5C)。
[0032] 圖6A-B顯示新的胰腺內(nèi)皮細(xì)胞源自供體BM。
[0033] 圖7A-D顯示Ig_GAD2的治療期間內(nèi)皮細(xì)胞祖細(xì)胞的轉(zhuǎn)移維持β-細(xì)胞再生并且 恢復(fù)血糖量正常。圖7Α-Β顯示與年齡相當(dāng)?shù)慕】档男∈笙啾?，糖尿病小鼠中表達(dá)內(nèi)皮祖細(xì) 胞（EPC)標(biāo)記物c-kit和FLK-1的ΒΜ細(xì)胞明顯減少。相比全ΒΜ-接受者小鼠，接收來自健 康供體的EPC的糖尿病小鼠展示更高的恢復(fù)速度（圖7C)。從糖尿病N0D-GFP小鼠分離的 EPC產(chǎn)生最小疾病恢復(fù)和最小移植GFP細(xì)胞至胰島（圖7C-D)。
[0034] _顯示用Ig_GAD2+BM治療糖尿病小鼠使得消除與出現(xiàn)糖尿病相關(guān)的胰島 素-抗性。
[0035] 圖9顯示在Ig_GAD2+BM治療期間，源自供體BM的細(xì)胞和產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞在第 30、60或120天沒有共定位（左圖）。在無糖尿病的小鼠中富含源自供體BM的細(xì)胞，但是 在相同方案的仍糖尿病的那些接受者中最?。ㄓ覉D）。
[0036] 圖10顯示用IgGAD2+BM治療的無糖尿病的小鼠的胰腺中上調(diào)編碼血管生成因子 的基因，包括VEGFa、血管生成素1和血管生成素2(圖10A)。圖10B顯示新形成的產(chǎn)生胰 島素的β-細(xì)胞也產(chǎn)生VEGFa。
[0037] 發(fā)明詳述
[0038] 用于治療包括1型糖尿?。═1D)的糖尿病的有效療法仍具有重要的醫(yī)學(xué)需要。最 近發(fā)現(xiàn)，抗原特異性療法（例如，Ig-GAD)誘導(dǎo)高血糖對象中的免疫調(diào)節(jié)，其能夠控制胰腺 炎、刺激細(xì)胞再生和預(yù)防T1D進(jìn)展。但是，當(dāng)相同的抗原特異性療法給予具有明顯T1D 的對象時，盡管與在治療高血糖對象中看到的類似的免疫調(diào)節(jié)，不能逆轉(zhuǎn)疾病的過程。令人 吃驚地，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)伴隨著骨髓（ΒΜ)細(xì)胞（例如，祖細(xì)胞）的轉(zhuǎn)移時，抗原特異性療 法能夠維持從明顯T1D的恢復(fù)。這樣，本公開提供了用于治療或預(yù)防T1D的組合物和方法。 這樣的方法可包括選擇患T1D的對象，和向?qū)ο笫┯糜行Я康慕M合物，其包括大量（例如， 有效量）的一個或多個干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞和大量（例如，有效量）的至少一種抗原特異性 療法。公開的組合物和方法可用于替換或補(bǔ)充用于治療和/或預(yù)防T1D的其他藥學(xué)方法。
[0039] 本公開提供了在需要其的對象中治療或預(yù)防糖尿病的方法，方法包括：向?qū)ο笫?用治療有效量的組合物，其包括一定量的一個或多個干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞和一定量的至少 一種抗原特異性療法。
[0040] 本公開也提供了組合物，其以治療有效量包括一定量的一個或多個干細(xì)胞和/或 祖細(xì)胞和一定量的至少一種抗原特異性療法。
[0041] 本公開也提供了組合物，其以治療有效量包括一定量的一個或多個干細(xì)胞和/或 祖細(xì)胞和一定量的至少一種抗原特異性療法，以維持β-細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞形成和逆轉(zhuǎn)糖尿 病。
[0042] 在本公開的一種實施方式中，糖尿病是1型糖尿病。1型糖尿?。═1D)的特征在 于自身免疫攻擊和損失胰腺中胰島的產(chǎn)生胰島素的貝塔細(xì)胞細(xì)胞）。疾病通過在本 領(lǐng)域通常稱為胰島炎前、胰島炎、高血糖，和明顯糖尿病的數(shù)個階段進(jìn)展?？赏ㄟ^血糖水平、 淋巴細(xì)胞滲透至胰腺細(xì)胞的程度，和胰腺β-細(xì)胞群確定疾病階段的診斷。如本文所使用， 術(shù)語"胰島炎"指發(fā)生胰腺滲透，使得受影響的胰島已經(jīng)丟失了它們的大部分細(xì)胞群 (約80%丟失）。如本文所使用，術(shù)語"胰島炎前"指胰腺滲透的早期階段使得有較小程度 的β-細(xì)胞群丟失（約〇%-40%丟失）。如本文所使用，術(shù)語"高血糖"指出現(xiàn)更高的正常 禁食血糖水平，通常大于約126mg/dL。如本文所使用，術(shù)語"明顯糖尿病"指基于血漿葡萄 糖水平，通常為約300mg/dL或更高、胰腺滲透，和大大減少的β-細(xì)胞群，診斷對象中完全 發(fā)作的糖尿病。
[0043] 在一個實施方式中，組合物施用至在T1D的胰島炎前階段的對象。在仍另一實施 方式中，在對象經(jīng)歷ΙΑΑ血清轉(zhuǎn)化之前，組合物施用至對象。在仍另一實施方式中，在對象 已經(jīng)血清轉(zhuǎn)化并且產(chǎn)生針對一個或多個β-細(xì)胞相關(guān)抗原的自抗體之前組合物施用至對 象。在仍另一實施方式中，組合物施用至ΙΑΑ陽性的對象。在另一實施方式中，組合物施用 至T1D胰島炎階段的對象。在仍另一實施方式中，在對象已經(jīng)發(fā)展了高血糖之前化合物施 用至對象。在本發(fā)明的另一實施方式中，當(dāng)開始治療時，對象已經(jīng)發(fā)展了高血糖。在仍另一 實施方式中，對象已經(jīng)診斷患明顯糖尿病。
[0044] 在任何上述方法或組合物的實施方式中，對象是哺乳動物包括，例如，人。
[0045] 術(shù)語"治療（treatment) "、"治療（treat) "和"治療（treating) "，如結(jié)合如本 文所描述的方法使用時，指臨時或永久、部分或完全消除、減少、抑制或減輕T1D的臨床癥 狀、表現(xiàn)或進(jìn)展（例如，診斷的事件、疾病或病況的癥狀、表現(xiàn)或進(jìn)展）。另外，或可選地，術(shù) 語"治療（treatment) "、"治療（treat)"和"治療（treating)"，如本文結(jié)合如描述的方法 所使用指臨時或永久、部分或完全抑制、延遲、抑制、減少、治療、消除或減輕T1D的臨床癥 狀或表現(xiàn)。在一些實施方式中，與在治療之前進(jìn)行的癥狀、跡象和/或病況的基線測量相 比，治療包括有效減輕對象中T1D的癥狀、跡象和/或病況至少約10% (例如，15%、20%、 25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或 100%)。在一些實施方式中，與在治療之前進(jìn)行的基線評估相比，治療有效改善包括用于診 斷對象中T1D的評估。如本文提供的這樣的治療不需要絕對有效。
[0046]如本文所使用，術(shù)語"預(yù)防（prevention) " "預(yù)防（prevent) "或"預(yù)防 (preventing) "指與沒有進(jìn)行測量的出現(xiàn)相比，消除或減少如本文所描述的T1D發(fā)病率或 出現(xiàn)。
[0047]如本文所使用，術(shù)語"需要治療的"指護(hù)理人員判斷患者需要或得益于治療。該 判斷的進(jìn)行基于護(hù)理人員領(lǐng)域的各種因素，但是包括患者展示T1D的臨床癥狀或表現(xiàn)的知 識。
[0048]如本文所使用，術(shù)語"有效量"指單獨或作為藥學(xué)組合物一部分的大量的組合物 (例如，包括一定量的一個或多個干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞和一定量的至少一種抗原特異性療 法的組合物），其當(dāng)施用至對象（例如，作為一個或多個劑量）時，能夠?qū)膊顟B(tài)或病況 的任何癥狀、方面、參數(shù)或特征具有任何可檢測的積極作用。這樣的作用不需要是絕對有益 的。
[0049] 干細(xì)胞和祖細(xì)胞和抗原特異性療法
[0050] 本公開考慮任何干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞和抗原特異性療法。
[0051] 干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞可分離自身體的許多組織。如本文所使用，術(shù)語"干細(xì)胞"指 能夠自我更新的未分化的細(xì)胞，意思是每個細(xì)胞分裂至少一個也是干細(xì)胞的子細(xì)胞。干細(xì) 胞也能夠分化成更成熟的細(xì)胞類型（例如，外胚層細(xì)胞系、中胚層細(xì)胞系和/或內(nèi)胚層細(xì)胞 系的細(xì)胞）。如本文所使用，術(shù)語"祖細(xì)胞"指源自干細(xì)胞的未分化的細(xì)胞，其能夠自我更新 并且分化，但是通常與干細(xì)胞相比，具有更