取代的香豆素-噻唑橙衍生物及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及取代的香豆素-嚷挫澄衍生物及其制備方法 和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] G四鏈體是一種非典型的核酸結(jié)構(gòu)。四個(gè)鳥嚷嶺堿基通過氨鍵作用力可W組成 G四聚體平面，而多層的G四聚體平面又可W形成G四鏈體。G四鏈體可W在生理?xiàng)l件下 由富G的DNA或RNA單鏈形成，并且可W在生物體內(nèi)穩(wěn)定存在。2013年，G四鏈體在哺乳 動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)存在的直接證據(jù)被提出，共聚交成像系統(tǒng)顯示G四鏈體在人類染色體的端粒 區(qū)域富集。[參見：G.Biffi,D.Tann址 化ffertyandS.Balasubramanian,化t. 化em.，2013, 5, 182-186.]隨后的研究證實(shí)，G四鏈體可能與癌癥有關(guān)，通過穩(wěn)定G四鏈體 可W減慢細(xì)胞的復(fù)制速率。[參見：（a)H.Xu,S.Gao,Q.Yang,D.Pan,L.WangandC.Fan,ACS Appl.Mater.Inte;rfaces, 2010, 2, 3211-3216 ; (b)S. (ihosh, 0.Mendoza,L.Qibo,F.Rosu,V. Gabelica,A.J.WhiteandR.Vilar,Chem.Eur.J. , 2014, 20, 4772-4779 ； (c)D.Zhao,X. Dong,N.Jiang,D.ZhangandC.Liu,Nucl.AcidsRes. , 2014, 42, 11612-11621.]也就是說， G四鏈體的穩(wěn)定劑可能就是潛在的抗癌藥物。因此，開發(fā)基于小分子的巧光探針用于識(shí)別G 四鏈體，引起了科研工作者越來越濃厚的興趣。
[0003] 嚷挫澄是一類經(jīng)典的染料，被用于核酸的顯色。然而它對(duì)于G四鏈體與雙鏈 DNA有相似的結(jié)合能力，低選擇性限制了嚷挫澄作為巧光探針的進(jìn)一步應(yīng)用。[參見：(a) Y.P.Xing,C.Liu,X.Η.ZhouandH.C.Shi,Sci.Rep. , 2015, 5, 8125 ； (b)I.Lubitz,D.Zikich andA.Kotlyar,Biochemistry, 2010, 49, 3567-3574.]科研工作者們希望在保留嚷挫澄良 好巧光性質(zhì)的同時(shí)，提高其對(duì)于G四鏈體的選擇性。為此，幾個(gè)嚷挫澄的衍生物也被開發(fā) 出來用于G四鏈體的巧光識(shí)別。[參見：（a)P.Yang，A.DeCian，M.P.Teulade-Fichou，J. L.Mer即yandD.Monchaud,Angew.Qiem.Int.Ed. , 2009, 48, 2188-2191 ; (b)Υ.J.Lu,S. C.Yan,F.Y.Qian,L.Zou,W.H.Chung,W.L.Wong,B.Qiu,N.Sun,P.H.Qian,Z.S.Huang,L.Q.Gu andK.Y.Wong,Qiem.Commun. , 2011, 47, 4971-4973.]運(yùn)兩個(gè)探針都可[^高效選擇性地與G 四鏈體結(jié)合，并且導(dǎo)致巧光大幅增強(qiáng)。然而，運(yùn)幾個(gè)探針的巧光發(fā)射波長(zhǎng)都較短，不利于生 物體內(nèi)的巧光成像。由于長(zhǎng)波巧光具有穿透能力強(qiáng)、生物組織傷害小等優(yōu)點(diǎn)，因此，設(shè)計(jì)合 成長(zhǎng)波發(fā)射的G四鏈體巧光探針是非常有必要的。
[0004] 取代的香豆素是一種便宜易得的化學(xué)原料，多個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)使其容易修飾，從而制 備很多香豆素衍生物，運(yùn)種衍生手段操作性和經(jīng)濟(jì)性都很強(qiáng)。利用取代的香豆素和嚷挫澄 可W構(gòu)建大共輛的體系，并且具備分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移，使其發(fā)光達(dá)到紅色甚至近紅外區(qū)域。而 取代的香豆素-嚷挫澄衍生物，又形成了月牙型的共面分子，使其能夠堆疊與G四聚體平面 上。與G四鏈體作用后的探針剛性增強(qiáng)，分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)受抑制，巧光大幅增強(qiáng)。因此運(yùn)類探針 可W高效選擇性地巧光識(shí)別G四鏈體，并用于細(xì)胞成像。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的第一個(gè)問題是提供一種取代的香豆素-嚷挫澄衍生物，其結(jié)構(gòu)式 如式I所示：
[0006]
[0007] 其中，R為C1~C8烷氧基、
-畑2或-0H;R1~R3獨(dú)立地為C1~ C8烷基或C1~C8幾基。
[000引作為本發(fā)明優(yōu)選的方案，R為C1~C4烷氧基、
妒R3.Ri~R3獨(dú)立地為 C1~C4烷基或C1~C4幾基。
[0009] 進(jìn)一步優(yōu)選的，R關(guān)
Ri~R3獨(dú)立地為C1~C4烷基或C1~C4幾 基。
[0010] 更進(jìn)一步優(yōu)選的，R為
Ri、R2獨(dú)立地為C1~C4烷基。
[0011] 最優(yōu)的，R為二乙基氨基。
[0012] 本發(fā)明還提供了上述取代的香豆素-嚷挫澄衍生物的制備方法，其反應(yīng)式如下：
[0013]
[0014] 上述取代的香豆素-嚷挫澄衍生物的制備方法包括W下步驟：
[0015] a、將取代的水楊醒和丙二酸二乙醋溶于無水有機(jī)溶劑中，然后再加入贓晚，回流 6~8小時(shí)，制備得到中間體1;
[001引 b、將中間體1溶于強(qiáng)酸中，回流反應(yīng)4~6小時(shí)，制備得到中間體2;
[0017] C、將中間體2、Ξ氯氧憐，在無水DMF(N，N-二甲基甲酯胺）中回流反應(yīng)2. 5~3. 5 小時(shí)，制備得到中間體3;
[001引 d、將中間體3,2-甲基嚷挫澄，贓晚在無水乙醇中回流反應(yīng)12~15小時(shí)，制備得 到取代的香豆素-嚷挫澄衍生物。
[0019] 其中，上述取代的香豆素-嚷挫澄衍生物的制備方法中，步驟a所述的丙二酸二乙 醋的摩爾量為取代水楊醒的2.0~2. 5倍，所述贓晚的摩爾量為取代水楊醒的1.2~1.6 倍。
[0020] 其中，上述取代的香豆素-嚷挫澄衍生物的制備方法中，步驟a所述的無水有機(jī)溶 劑為無水乙醇。
[0021] 其中，上述取代的香豆素-嚷挫澄衍生物的制備方法中，步驟b所述的強(qiáng)酸為質(zhì)量 百分比18 %~20%的濃鹽酸。
[0022] 其中，上述取代的香豆素-嚷挫澄衍生物的制備方法中，步驟C所述的Ξ氯氧憐的 用量為中間體2的1.6~1.8倍。
[0023] 其中，上述取代的香豆素-嚷挫澄衍生物的制備方法中，步驟d所述的2-甲基嚷 挫澄與中間體3的摩爾比為1:1。
[0024] 本發(fā)明還提供了上述的取代的香豆素-嚷挫澄衍生物在對(duì)G四鏈體進(jìn)行巧光識(shí)別 的用途。
[00巧]本發(fā)明利用取代香豆素的醒基和2-甲基嚷挫澄縮合構(gòu)建長(zhǎng)波發(fā)射的巧光體系， 設(shè)計(jì)合成了一種發(fā)射紅色巧光的G四鏈體巧光探針。本發(fā)明通過在含有強(qiáng)供電子基團(tuán)的取 代香豆素中引入強(qiáng)吸電子基的嚷挫澄部分，使得整個(gè)化合物的發(fā)射波長(zhǎng)可W紅移到600nm W上，完全滿足生物實(shí)驗(yàn)中對(duì)巧光波長(zhǎng)的需求。嚷挫澄部分的引入也可W使化合物對(duì)于 G-四鏈體有更好的選擇性結(jié)合能力，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)G-四鏈體的專一性識(shí)別。該系列化合物 對(duì)G四鏈體具有優(yōu)良的選擇性、靈敏性，抗干擾能力強(qiáng)，可W在生物體內(nèi)高效地檢測(cè)G四鏈 體的存在。此外，本發(fā)明提供的取代的香豆素-嚷挫澄衍生物具有毒副性小、原料簡(jiǎn)單易 得、整條合成路線可操作性強(qiáng)、反應(yīng)條件也比較溫和、總體成本較低等優(yōu)勢(shì)，和現(xiàn)有低效的 G-四鏈體巧光探針相比，無疑更有市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。
【附圖說明】
[0026] 圖1化合物5的氨譜圖。
[0027] 圖2化合物5的MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。
[0028] 圖3不同濃度的化合物5與化La細(xì)胞共培養(yǎng)后，用流式細(xì)胞分析技術(shù)分析細(xì)胞膜 通透率。其中，A、B、C、D圖分別為：0、1.0、3.0、5.041濃度的化合物5與化1^曰細(xì)胞共培養(yǎng) 后的結(jié)果圖。
[0029] 圖4Ι.ΟμΜ化合物5和市售線粒體巧光探針Mito-TrackerGreen在化la細(xì)胞中 共同解化后的共聚焦巧光成像圖。其中，A圖為Mito-TrackerGreen的巧光成像圖（488皿 激發(fā)，500-540皿收集）；B圖為化合物5的巧光成像圖（488皿激發(fā)，630-670皿收集）；C圖 為A圖和B圖的疊加圖。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 取代的香豆素-嚷挫澄衍生物的制備方法包括W下步驟：
[0031] a、將取代的水楊醒和丙二酸二乙醋溶于無水有機(jī)溶劑中，然后再加入贓晚，回流 6~8小時(shí)，制備得到中間體1;所述的丙二酸二乙醋的用量為取代水楊醒的2.0~2. 5倍， 所述贓晚的用量為取代水楊醒的1.2~1.6倍；
[003引b、將中間體1溶于強(qiáng)酸中，回流反應(yīng)4~6小時(shí)，制備得到中間體2;
[003引 C、將中間體2、Ξ氯氧憐，在無水DMF(N，N-二甲基甲酯胺）中回流反應(yīng)2. 5~3. 5 小時(shí)，制備得到中間體3;所述的Ξ氯氧憐的用量為中間體2的1.6~1.8倍；
[0034]d、將中間體3, 2-甲基嚷挫澄，贓晚在無水乙醇中回流反應(yīng)12小時(shí)，制備得到取代 的香豆素-嚷挫澄衍生物；所述的2-甲基嚷挫澄與中間體3的摩爾比為1:1;
[0035] 其中，上述取代的香豆素-嚷挫澄衍生物的制備方法中，步驟a所述的無水有機(jī)溶 劑為無水乙醇。
[0036] 其中，上述取代的香豆素-嚷挫澄衍生物的制備方法中，步驟b所述的強(qiáng)酸為質(zhì)量 百分比18 %~20%的濃鹽酸。
[0037] 在合成中間體1的過程中，反應(yīng)的產(chǎn)率較高，但仍有很多副產(chǎn)物。嘗試通過柱層析 色譜分純（石油酸：乙酸乙醋=3 : 1)，效果不佳，幾乎全部的副產(chǎn)物隨著產(chǎn)物一起被收集 至IJ。因此沒有必要通過柱層析色譜分純，可直接用于下一步反應(yīng)。
[0038] 在合成中間體2的過程中，可通過薄層色譜及時(shí)檢測(cè)反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間可適 當(dāng)延長(zhǎng)。在后處理過程中，加入45%氨氧化鋼溶液調(diào)節(jié)抑至4~5,應(yīng)當(dāng)注意不可調(diào)到過 堿，香豆素在抑>10的條件下內(nèi)醋鍵會(huì)斷裂。
[0039] 在合成中間體3的過程中，POCI3用量?jī)?yōu)選為中間體2的1. 7倍當(dāng)量，也可W適當(dāng) 提高其用量，W防止溶劑中殘留的水W及反應(yīng)體系中的水，使Ξ氯氧憐失去活性。中間體3 需要先溶解在DMF中，再通過恒壓滴液漏斗加入，W減少副反應(yīng)的發(fā)生。
[0040] 在合成取代的香豆素-嚷挫澄衍生物的過程中，優(yōu)選贓晚催化反應(yīng)，堿性過強(qiáng)或 者過弱都不利于反應(yīng)的進(jìn)行。2-甲基嚷挫澄在無水乙醇中的溶解性不好，在反應(yīng)開始前不 能完全溶解，而隨著反應(yīng)的發(fā)生會(huì)逐漸全部溶解。反應(yīng)的溶劑可W隨著堿的不同而變化。
[0041] 本發(fā)明實(shí)施例中，所有的寡核巧酸都購(gòu)Sangon公司，化La細(xì)胞株購(gòu)于 ATCC(Ame;ricanTypeQiltureCollection)公司，10%胎牛血清購(gòu)于Hyclone公司， DMEM(H)培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco。線粒體染料Mito-TrackerGreen均購(gòu)自于Life Technologies公司。
[0042] 實(shí)施例1中間體1的合成：
[0043]
[0044]將 4-二乙胺基水楊醒（10. 0g，56. 4mmol)、丙二酸二乙醋（18.Og，112. 4mmol)、贓 晚（2血，79.Ommol)溶于60血無水乙醇