Agt蛋白抑制劑、其制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及制藥領(lǐng)域，具體地說，設(shè)及一種新型的AGT蛋白抑制劑、其制備方法及 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[000引 06-烷基鳥嚷嶺-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶（AGT)是一種DNA修復(fù)蛋白，它能夠?qū)κ艿綗?損傷的DNA分子進(jìn)行修復(fù)，將烷基鳥嚷嶺06位上結(jié)合的烷基基團(tuán)從鳥嚷嶺轉(zhuǎn)移到自身活性 位點(diǎn)的半脫氨酸殘基上，從而保護(hù)DNA不受燒化劑的損傷。研究表明，鳥嚷嶺06位上的甲 基、2-氯乙基、芐基和氮苯基氧代下基等基團(tuán)均可被AGT移除。然而，在燒化劑類抗腫瘤藥 物的臨床應(yīng)用中，腫瘤細(xì)胞中的AGT能通過修復(fù)燒化劑導(dǎo)致的DNA損傷而使得腫瘤細(xì)胞對(duì) 燒化劑類抗癌藥物產(chǎn)生耐藥性，最終導(dǎo)致化療失敗。例如，對(duì)于雙官能團(tuán)燒化劑二氯乙基亞 硝基脈度CNU，卡莫司?。?，AGT能夠通過修復(fù)BCNU導(dǎo)致的06-氯乙基鳥嚷嶺中間體而阻斷 DNA股間交聯(lián)的形成，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)BCNU產(chǎn)生耐藥性。因此，設(shè)計(jì)開發(fā)有效的AGT抑制 劑并將其與燒化劑類抗癌藥物聯(lián)合應(yīng)用于腫瘤化療，對(duì)于增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感 性、降低耐藥性、提高化療效果具有重要意義。
[000引 06-芐基鳥嚷嶺是目前在臨床試驗(yàn)中應(yīng)用最廣泛的AGT抑制劑，可W在15分鐘內(nèi) 完全抑制人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞中的AGT活性，同時(shí)提高腫瘤細(xì)胞對(duì)環(huán)己基氯乙基亞硝基脈的 敏感性。但是，由于06-芐基鳥嚷嶺存在活性有限、水溶性差的問題，尤其是不具有腫瘤細(xì) 胞祀向性，因此未能在臨床上得到廣泛的應(yīng)用。研究表明，06-芐基鳥嚷嶺在抑制腫瘤細(xì)胞 AGT活性的同時(shí)也大大降低了正常細(xì)胞中AGT的含量，從而引起化療藥物的骨髓抑制毒性 顯著增強(qiáng)，最終導(dǎo)致化療失敗。因此，設(shè)計(jì)開發(fā)具有腫瘤細(xì)胞祀向性的新型AGT抑制劑，使 其能夠特異性地作用于腫瘤細(xì)胞并發(fā)揮AGT抑制活性，是提高腫瘤細(xì)胞敏感性、同時(shí)保護(hù) 正常細(xì)胞不受化療藥物損傷，從而實(shí)現(xiàn)高效低毒的治療策略的重要途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種新型的具有高活性的腫瘤細(xì)胞祀向性AGT蛋白抑制劑、 其制備方法及應(yīng)用。
[0005] 由于腫瘤細(xì)胞的快速生長(zhǎng)能夠造成腫瘤內(nèi)部缺氧，因此，低氧是實(shí)體瘤中存在的 一種普遍現(xiàn)象。本發(fā)明利用腫瘤低氧運(yùn)一特點(diǎn)，合成了一類具有低氧激活的AGT蛋白抑制 劑，該類化合物在正常組織中不能被激活，因而不會(huì)抑制正常細(xì)胞中的AGT活性；但卻能夠 特異性地在腫瘤細(xì)胞低氧條件下被激活，產(chǎn)生具有AGT抑制活性的化合物。因此，該類化合 物能夠特異性的抑制腫瘤細(xì)胞的AGT活性，祀向性地提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性， 從而與燒化劑類抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用于腫瘤化療。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的一種具有低氧激活特性的AGT蛋白抑制劑， 所述抑制劑為具有如通式（I)結(jié)構(gòu)所示的化合物：
[0007]
[0008] 優(yōu)選地，所述抑制劑為ο6- (2-硝基芐基）-9氨-鳥嚷嶺（化合物1)、ο6- (3-硝基 芐基）-9氨-鳥嚷嶺（化合物2)、06- (4-硝基芐基）-9氨-鳥嚷嶺（化合物3):
[0009]
[0010]
[0011] 本發(fā)明還提供所述AGT蛋白抑制劑的制備方法，包括W下步驟：
[001引1)2-氨基-6-氯嚷嶺（a)與1-甲基化咯燒反應(yīng)生成化合物化），即1-(2-氨 基-9-氨-嚷嶺-6-) -1-甲基化咯燒氯化物；
[001引。式（Π)化合物與化合物化）反應(yīng)生成所述抑制劑。
[0014] 其中，化合物化）的結(jié)構(gòu)式如下：
[0015]
[0016] 式（II)化合物的結(jié)構(gòu)通式如下，硝基位于鄰位、間位或?qū)ξ唬?br>[0017]
[0018] 上述反應(yīng)過程如下：
[00191
[0020] 前述的方法，步驟1)具體為：將2-氨基-6-氯嚷嶺（a)溶于有機(jī)溶劑，加入1-甲 基化咯燒，攬拌反應(yīng)，反應(yīng)生成化合物化），反應(yīng)結(jié)束后向溶液中加入丙酬并繼續(xù)攬拌至化 合物化）完全沉淀，過濾并將收集到的固體，用乙酸洗涂2次，真空干燥，得到干燥的化合物 化)。
[0021] 步驟1)中2-氨基-6-氯嚷嶺與1-甲基化咯燒的摩爾比為1:1-4,優(yōu)選1:2-3 ; 所述有機(jī)溶劑為N，N-二甲基甲酯胺或二甲基亞諷，優(yōu)選N，N-二甲基甲酯胺，有機(jī)溶劑用量 為按2-氨基-6-氯嚷嶺Immol計(jì)，使用有機(jī)溶劑10-15mL;反應(yīng)溫度控制在20-40°C，優(yōu)選 25-35Γ;反應(yīng)時(shí)間為12-24小時(shí)，優(yōu)選16-20小時(shí)。
[0022] 前述的方法，步驟2)具體為：將式（II)化合物溶于有機(jī)溶劑中，加入步驟1)得到 的化合物化）、氨化鋼與二甲基氨基化晚，在惰性氣體保護(hù)下攬拌反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后加入冰 乙酸水溶液W中和過量的氨化鋼至溶液pH= 7,然后加入飽和氯化錠與乙酸乙醋按體積比 1 :1組成的混合液進(jìn)行萃取，萃取后的乙酸乙醋層再用去離子水洗涂2次，真空干燥，得到 式（I)化合物的粗產(chǎn)物，將粗產(chǎn)物用硅膠柱層析法純化，即得所述抑制劑。
[0023] 步驟2)中二甲氨基化晚、化合物化）、式（II)化合物與氨化鋼的摩爾比為 1:6-12:10-50:30-60，優(yōu)選1:8-10:20-30:40-50 ;所述有機(jī)溶劑為N,N-二甲基甲酯胺或二 甲基亞諷，優(yōu)選N，N-二甲基甲酯胺，有機(jī)溶劑用量為按化合物化計(jì)，使用有機(jī)溶劑 10-15血；反應(yīng)溫度控制在20-35°C，優(yōu)選25-30°C;反應(yīng)時(shí)間為3-6小時(shí)，優(yōu)選4-5小時(shí)。
[0024] 優(yōu)選地，步驟2)中硅膠柱層析法純化時(shí)所用的洗脫劑為甲醇和二氯甲燒的混合 液，采用梯度洗脫的方法，混合液中甲醇與二氯甲燒的體積比由1:50逐漸變?yōu)?:10。
[0025] 本發(fā)明具有低氧激活特性的AGT蛋白抑制劑具有W下優(yōu)點(diǎn)：
[0026] ( -）本發(fā)明提供的式（I)化合物能夠特異性的在低氧條件下激活，硝基基團(tuán)被 還原為氨基基團(tuán)，生成具有AGT抑制活性的〇6-芐基鳥嚷嶺衍生物，即〇6-(氨基芐基）-9 氨-鳥嚷嶺，從而實(shí)現(xiàn)祀向性的作用于腫瘤細(xì)胞并發(fā)揮AGT抑制作用，達(dá)到提高腫瘤細(xì)胞對(duì) 抗癌燒化劑敏感性的目的。
[0027] (二）對(duì)式（I)化合物進(jìn)行體外抗腫瘤篩選試驗(yàn)，結(jié)果表明，在低氧條件下，式（I) 化合物與BCNU聯(lián)合用藥，在低氧條件下，對(duì)鼻咽癌細(xì)胞KB、人宮頸癌細(xì)胞化laS3、人腦神經(jīng) 膠質(zhì)瘤細(xì)胞SF763、人前列腺癌細(xì)胞DU145、人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29細(xì)胞和淋己瘤細(xì)胞Raji均 有明顯的抑制作用；而在有氧條件下，式（I)化合物與BCNU聯(lián)合用藥，對(duì)上述腫瘤細(xì)胞的抑 制作用不明顯。因此，式（I)化合物具有良好的祀向性，能夠顯著提高腫瘤細(xì)胞對(duì)燒化劑類 抗腫瘤藥物的敏感性，可用于腫瘤的祀向聯(lián)合化療。
[0028] (Ξ)與現(xiàn)有的AGT蛋白抑制劑相比，式（I)化合物還具有活性更高、水溶性更強(qiáng) 的優(yōu)點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0029] W下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例 中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0030] W下實(shí)施例中設(shè)及的式（II)化合物的結(jié)構(gòu)通式如下：
[0031]
[0032] 其中，硝基位于鄰位、間位或?qū)ξ粫r(shí)對(duì)應(yīng)的化合物分別為（C)、（d)、（e)。
[0033] W下實(shí)施例中設(shè)及的化合物1、化合物2和化合物3的結(jié)構(gòu)式如下：
[0034]
[0035]
[0036] 實(shí)施例1 06- (2-硝基芐基）-9氨-鳥嚷嶺（化合物1)的合成
[0037] (1) 1-(2-氨基-9-氨-嚷嶺-6-)-1-甲基化咯燒氯化物化）的合成
[003引將356mg(2.ImmoU2-氨基-6-氯嚷嶺（a)溶于30血N,N-二甲基甲酯胺中，加入 0. 33mU6. 2mmol) 1-甲基化咯燒，反應(yīng)物全部溶解后整個(gè)反應(yīng)體系在25°C條件下攬拌反應(yīng) 17小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后在溶液中加入2mL丙酬并繼續(xù)攬拌至完全沉淀，過濾，收集固體經(jīng)乙酸 洗涂2次，真空干燥，得到化合物（b)300mg(l.ISmmol)，產(chǎn)率56%。
[003引化合物化）的特征如下：
[0040] υνλ :289nm;
[0041] IR(邸r壓片）v/cmi:：M45. 4(N-H)，3274. 9(畑2)，2974. 9(C-H)，1719. 3(C =腳， 1552. 7 (C = C)；
[0042]iH-NMR(DMSO-de)δ;1. 73(m, 2H,畑2)，2. 90(s, 3H,畑3)，3. 24(m, 2H,畑2)， 6. 99 (s, 2H,畑2)，8. 57 (s,IH,CH)，11. 00 (s,IH,N田；
[0043]ESI-MS：255[M+H]"〇
[0044] 似化合物1的合成
[004引將524mg(3. 42mm0U化合物（c)溶于15血N，N-二甲基甲酯胺中，依次加入 147mg化llmmol)氨化鋼（NaH)、300mg(l.ISmmol)步驟（1)中制得的化合物化）W及 17mg(0. 14mmol)二甲基氨基化晚固體，全部溶解后于氣氣保護(hù)下在25°C環(huán)境攬拌反應(yīng)4小 時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后加入冰乙酸水溶液W中和過量的氨化鋼至溶液抑=7,然后加入飽和氯化 錠與乙酸乙醋按照體積比為1:1組成的混合液進(jìn)行萃取，萃取后的乙酸乙醋層再用去離子 水洗涂2次，真空干燥，得到化合物1的粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物用硅膠柱層析法純化，洗脫劑為 甲醇和二氯甲燒，采用梯度洗脫的方法，從甲醇/二氯甲燒（v/v) 1:50逐漸變?yōu)?:10,得到 化合物 1 220mg(0. 77mmol)，產(chǎn)率 65%。
[0046] 化合物1的特征如下：
[0047]UVλ；239nm；
[0048]IR(邸r壓片）v/cmi:3412. 6(N-H)，2924. 4(-CH廠），1592. 5(C=C)，1460.8(C= N) ；1397. 5(C-0-C)；
[0049]iH-醒R(DMSO-de)δ;5. 16(s, 2H,邸2)，6. 99(s, 2H,畑2)，7. 62-8. 01 (m, 4H, 〇6&)， 8. 57(s,lH，CH)，11.00(s,IH'NH);
[0050]ESI-MS：287[M+H]"〇
[0051] 實(shí)施例2O6- (2-硝基芐基）-9氨-鳥嚷嶺（化合物1)的合成
[005引（1) 1-(2-氨基-9-氨-嚷嶺-6-)-1-甲基化咯燒氯化物化）的合成
[0053] 將322mg(1.9mm〇