一種基于環(huán)二腺核苷酸的衍生物、tat多肽及其在一型干擾素小分子中抑制劑的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本技術(shù)屬于免疫學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域
【背景技術(shù)】
[0002] 干擾素及其杭病毒作用
[0003] 干擾素是1957年英國科學(xué)家Isaacs和Lindenmann在研究病毒干擾現(xiàn)象時(shí)發(fā)現(xiàn) 的。所謂病毒干擾現(xiàn)象就是一種病毒感染某個(gè)細(xì)胞后能夠干擾隨后的其它病毒對(duì)該細(xì)胞的 感染。最初，科學(xué)家們把滅活的流感病毒接種于雞胚細(xì)胞內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)運(yùn)些細(xì)胞可W分泌一 種可溶性物質(zhì)來抑制和干擾流感病毒的復(fù)制，所W將運(yùn)種物質(zhì)命名為干擾素。干擾素是誘 生蛋白，正常細(xì)胞一般不自發(fā)產(chǎn)生干擾素，只存在合成干擾素的潛能，干擾素的基因處于被 抑制的靜止?fàn)顟B(tài)。根據(jù)干擾素的來源、生物學(xué)性質(zhì)及活性可分為W下兩大類。
[0004] I型干擾素：I型干擾素包括IFN-a與IFN-β等。IFN-a主要由單核-巨隧細(xì)胞 產(chǎn)生，此外B細(xì)胞和成纖維細(xì)胞也能合成IFN-a;IFN-e主要由成纖維細(xì)胞產(chǎn)生。IFN-a/ β二者結(jié)合相同受體，分布廣泛，包括單核-巨隧細(xì)胞、多形核白細(xì)胞、Β細(xì)胞、Τ細(xì)胞、血業(yè) 扳、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞等。
[000引 II型干擾素：II型干擾素即丫干擾素，主要由活化的Τ細(xì)胞（包括化0、??1細(xì)胞 和幾乎所有的CD8巧細(xì)胞）和ΝΚ細(xì)胞產(chǎn)生，是所謂的淋己因子化yTnPhokine)的一種。
[0006] -型干擾素的抗病毒活性很強(qiáng)，ImgIFN-a可達(dá)2億W上國際單位，一個(gè)細(xì)胞只 要有10個(gè)甚至1個(gè)分干擾素，即可促進(jìn)其自發(fā)性免疫反應(yīng)從而達(dá)到產(chǎn)生抗病毒的狀態(tài)。干 擾素既是天然的抗病毒蛋白質(zhì)，且活性很強(qiáng)，對(duì)病毒的作用范圍也很廣。2005年，聚乙二醇 重組干擾素α-?通過美國抑A批準(zhǔn)，正式用于乙肝治療。在SARS爆發(fā)期間，干擾素對(duì)SARS 起到很好的預(yù)防和治療作用。國內(nèi)有人曾用干擾素噴劑（300IU/10ml)試用過10000多人， 也未出現(xiàn)不良反應(yīng)，更不會(huì)引起全身發(fā)熱，因此干擾素噴劑是絕對(duì)安全的。
[0007]一巧干擾素的誘導(dǎo)旅巧
[0008] 在未被感染的正常細(xì)胞中，一型干擾素的表達(dá)是受到抑制的。近幾年來的研究掲 示了詳細(xì)的一型干擾素分子誘導(dǎo)機(jī)制。宿主細(xì)胞內(nèi)廣泛存在一種可W識(shí)別細(xì)胞質(zhì)內(nèi)外源 DNA的受體蛋白cGAS。當(dāng)病毒、細(xì)菌DNA暴露在細(xì)胞中后，該受體蛋白cGAS會(huì)與DNA結(jié)合并 激活其環(huán)化酶酶活性從而將一分子的Ξ憐酸腺巧（AT巧和一分子的Ξ憐酸鳥巧（GT巧水解 環(huán)化成2 '5'環(huán)二核巧酸C-AMP-GMP。該環(huán)二核巧酸分子進(jìn)而可W和細(xì)胞內(nèi)Sting效應(yīng)雙 分子聚合體結(jié)合，促進(jìn)其構(gòu)象發(fā)生改變并活化該酶分子。隨后Sting激活下游的激酶TBK1 從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子IRF3的活性來誘導(dǎo)一型干擾素的表達(dá)（圖1)。
[0009] 除了細(xì)菌、病毒DNAW外，近年來研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌合成的多種環(huán)二核巧酸，包括大 腸桿菌生成的3 '5'環(huán)二鳥巧酸和李氏桿菌生成的3 '5'環(huán)二腺巧酸均被證明可W直接和 Sting結(jié)合，從而跳過cGAS分子而直接誘導(dǎo)一型干擾素的高量表達(dá)。
[00…]Sting過麼激活引起的巧病
[0011] sting作為一型干擾素合成通路中至關(guān)重要的一個(gè)效應(yīng)蛋白，它的表達(dá)和功能起 著至關(guān)重要的免疫平衡調(diào)節(jié)作用。最新的一些臨床研究發(fā)現(xiàn)，Sting的過度活化和系統(tǒng)性 紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的發(fā)病有著重要的關(guān)聯(lián)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 發(fā)明目的：sting作為一型干擾素生成通路中的重要分子，它的活性在維持細(xì)胞 自發(fā)性免疫反應(yīng)與炎癥反應(yīng)中起了至關(guān)重要的作用。因此我們通過對(duì)細(xì)菌環(huán)二腺核巧酸衍 生物篩選和定向修飾，旨在開發(fā)一系列具有良好細(xì)胞通透性的小分子，可W特異性的激活 或阻斷Sting-TBKl-I型干擾素信號(hào)通路，從而達(dá)到促進(jìn)（抗病毒）及抑制（過度免疫活化， 例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡）自發(fā)性免疫反應(yīng)的的作用。
[0013] 技術(shù)方案：一種環(huán)二腺核巧酸衍生物1，是3 '5'環(huán)二鳥巧酸（式I)在核糖體2位 徑基位置連接了一個(gè)烘控基團(tuán)（式II)，分子量為696. 4道爾頓，其結(jié)構(gòu)如下：
[0014]
〇
[0015] 環(huán)二腺核巧酸衍生物1的應(yīng)用，可阻斷3'5'環(huán)二腺巧酸引起的人外周血細(xì)胞1型 干擾素表達(dá)分泌。
[0016] 3' 5'環(huán)二腺巧酸衍生物1-tat多膚聚合體，物質(zhì)是由環(huán)二腺巧酸衍生物反應(yīng)得 至IJ，其如下結(jié)構(gòu)：
[0017]
[0018] 3' 5'環(huán)二腺巧酸衍生物1-tat多膚聚合體化學(xué)反應(yīng)過程，在3' 5'環(huán)二腺巧酸 衍生物篩選過程中加入了烘控集團(tuán)，可用于點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)連接促進(jìn)穿透細(xì)胞的官能團(tuán)或多 膚，利用點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)的方法連接了可W促進(jìn)細(xì)胞膜穿透性的艾滋病病毒多膚tat,反應(yīng)過 程如下：
[0019]
[0020] 其反應(yīng)流程如下：
[0021] 1)在反應(yīng)管中依次加入如下溶液
[0022] 3' 5'環(huán)二腺巧酸衍生物1、化S04、疊氮修飾的tat多膚如下；其中包含了 2個(gè)用 于連接的柔性甘氨酸分子和11個(gè)來源于艾滋病病毒HIVTat蛋白的穿膜多膚
[0023]疊氮（azide)N3-GGYGRKKRRQRRR
[0024] 25μ1 5mMaminoguanidine.
[00巧]25μ1 5mMsodiumascorbate
[0026] 2)將反應(yīng)管關(guān)閉后顛倒混合均勻，然后放置在室溫?fù)u床或旋轉(zhuǎn)混合器上反應(yīng)；
[0027] 3)反應(yīng)產(chǎn)物用高效液相色譜HPLC進(jìn)行純化。
[0028] 3' 5'環(huán)二腺巧酸衍生物1-tat多膚聚合體應(yīng)用，阻斷3' 5'環(huán)二腺巧酸引起的人 外周血細(xì)胞1型干擾素表達(dá)分泌。
[0029] 有益效果：3' 5'環(huán)二腺巧酸衍生物1、3' 5'環(huán)二腺巧酸衍生物1-tat多膚聚合體 能有效降低一型干擾素在PMBC中的生成。
【附圖說明】
[0030] 圖l:Sting-TBKl-IRF3-型干擾素合成通路
[0031] 圖2:3' 5'環(huán)二腺巧酸合成物結(jié)構(gòu)及分子量
[0032]A:3' 5'環(huán)二腺巧酸合成物分子結(jié)構(gòu)圖B:基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時(shí)間 (MALDI)質(zhì)譜分析
[0033] 圖3:3' 5'環(huán)二腺巧酸衍生物1-Sting括抗劑結(jié)構(gòu)及分子量
[0034]A:3'5'環(huán)二腺巧酸衍生物1-Sting括抗劑結(jié)構(gòu)B:基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時(shí) 間（MLDI)質(zhì)譜分析
[003引圖4:3'5'環(huán)二鳥巧酸衍生物1不能刺激人外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheralblood mononuclearcell,PBMC)分泌一型干擾素al地a
[0036] 圖5:3' 5'環(huán)二腺巧酸衍生物1-括抗劑阻斷3' 5'環(huán)二腺巧酸引起的人外周血細(xì) 胞1型干擾素表達(dá)分泌
[0037] 圖6:3' 5'環(huán)二腺巧酸衍生物1與HIV tat多膚的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng) [003引圖7:3' 5'環(huán)二腺巧酸衍生物1-tat細(xì)胞通透性及Sting括抗效果
【具體實(shí)施方式】
[0039] 3' 5'環(huán)二腺巧酸衍生物1-括抗劑
[0040] 3' 5'環(huán)二腺巧酸祈牛物1-枯杭劑結(jié)構(gòu)及分子量
[0041] 通過化學(xué)合成的方法，我們合成了多種環(huán)二核巧酸（圖2)衍生物。通過體外細(xì)胞 活性實(shí)驗(yàn)，我們篩選到了一個(gè)基于3 '5'環(huán)二鳥巧酸的小分子衍生物1結(jié)構(gòu)（圖3)。該分 子是在核糖體2位徑基位置連接了一個(gè)烘控基團(tuán)，分子量為696. 4道爾頓。
[0042] 3' 5'環(huán)二腺巧酸祈牛物1-枯杭劑不能引起人外周血單個(gè)核細(xì)胸巧erioheral blood mononuclearcell.PBMC)分泌1型干擾素
[0043] 通過體外活性實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)3 '5'環(huán)二鳥巧酸的小分子衍生物1與3 '5'環(huán)二鳥 巧酸相比不能刺激人PBMC產(chǎn)生一型干擾素。具體實(shí)驗(yàn)步驟及結(jié)果如下
[0044]a.人外周血PBMC的制備
[0045] 1)在短中管中加入適量淋己細(xì)胞分離液。
[0046] 2)取肝素抗凝靜脈血與等量RPMI1640充分混勻，用滴管沿管壁緩慢疊加于分層 液面上，注意保持清楚的界面。水平離屯、2000rpmX20分鐘。
[0047] 3)離屯、后管內(nèi)分為Ξ層，上層為血漿和RPMI1640液，下層主要為紅細(xì)胞和粒細(xì) 胞。中層為淋己細(xì)胞分離液，在上、中層界面處有一W單個(gè)核細(xì)胞為主的白色云霧層狹窄 帶，單個(gè)核細(xì)胞包括淋己細(xì)胞和單核細(xì)胞。此外，還含有血小板。
[0048] 4)用毛細(xì)血管或200μ1槍頭插到云霧層，吸取單個(gè)核細(xì)胞。置入另一短中管中， 加入5倍W上體積的RPMI1640,1500巧mX10分鐘，重復(fù)洗涂細(xì)胞兩次。
[0049] 5)末次離屯、后，棄上清，加入含有10%小牛血清的RPMI1640,重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。
[0050] b.-型干擾素誘導(dǎo)活性的測(cè)定
[0051] 1)將500μ1 2xl〇VmlPBMC加入到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，然后靜置于37°C含有5% C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)使之貼壁。
[005引。將不同濃度的3V環(huán)二鳥巧酸及其衍生物1與100μΜDigitonin混合，然后 加入到PBMC培養(yǎng)液上清中。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置15分鐘。Digitonin作為柔性非離子去 污劑可W增加細(xì)胞膜的通透性，從而幫助待測(cè)樣品進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。
[0053] 3)用預(yù)熱的含有10%FBS的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液洗涂細(xì)胞兩次，然后加入500ul 新鮮的培養(yǎng)液，然后放回細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。
[0054] 4)培養(yǎng)5小時(shí)候，用無菌移液器移取培養(yǎng)液上清。然后利用ebioscience公司的 一型干擾素alpha酶聯(lián)免疫試劑盒依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定培養(yǎng)上清中一型干擾素的濃度。[005引C.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表巧日?qǐng)D4,在如上的測(cè)試條件下，2μΜ的3