一種Bt蛋白Cry1Ie5、其編碼基因及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種化蛋白及其編碼基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在人類生產(chǎn)過程中，蟲害是造成農(nóng)業(yè)生產(chǎn)損失及影響人類健康的重要因素。據(jù)FA0 統(tǒng)計，全世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)每年因蟲害造成的經(jīng)濟損失高達14%，病害損失達12%，草害損失達 11%。損失額高達1260億美元，相當于中國農(nóng)業(yè)總產(chǎn)值的一半，英國的4倍多。為了減少送 些損失，多年來，對農(nóng)作物害蟲及蚊蟲普遍采用化學(xué)防治手段進行防治，但由于化學(xué)農(nóng)藥的 長期、大量使用，造成了對環(huán)境的污染，農(nóng)副產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量增加，給人類的生存和健康 帶來了危害。此外，化學(xué)農(nóng)藥在殺滅害蟲的同時，也殺傷了天敵及其它有益物，破壞了生態(tài) 平衡。與化學(xué)防治相比，生物防治具有安全、有效、持久的特點。并且避免了化學(xué)防治帶來 的一系列問題。因此，生物防治技術(shù)成了人們研究的熱點。在生物殺蟲劑中，蘇云金芽抱桿 菌是目前世界上用途最廣、產(chǎn)量最大的一類微生物殺蟲劑。
[0003] 蘇云金芽抱桿菌(《acinusiAyrin知eftsis,簡稱Bt)是一種革蘭氏陽性細菌，它 的分布極為廣泛，在芽抱形成的同時可形成具有殺蟲活性的由蛋白質(zhì)組成的伴胞晶體，又 名殺蟲晶體蛋白（Insectididalciystalproteins,簡稱ICPs)，ICPs是由C巧^基因編碼 的，對敏感昆蟲有強烈毒性，而對高等動物和人無毒性。目前在農(nóng)田害蟲、森林害蟲及衛(wèi)生 害蟲的防治中化已成為化學(xué)合成農(nóng)藥的有力替代品，化還是轉(zhuǎn)基因抗蟲工程植物重要的 基因來源。
[0004] 自1981年Schn巧f從菌株皿-1中克隆了第一個能表達殺蟲活性的基因W來，人 們已經(jīng)分離克隆了 500多種編碼殺蟲晶體蛋白的基因，根據(jù)編碼的氨基酸序列同源性它 們被分別確定為不同的群、亞群、類和亞類（CrickmoreN,eiai.MicrobiolMolBiol Rev, 1998, 62:807-813;ht1:p://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil-Crickmore/Bt/)。一 般而言，CoA 和Cr抑等毒蛋白對鱗翅目害蟲有效；其中研究的最多的是和 類蛋白，它們編碼的殺蟲晶體蛋白分子量為130-140kD，許多基因目前已被廣泛應(yīng) 用于植物的鱗翅目害蟲的防治。蘇云金芽胞桿菌W色列亞種化iAyri化?ieftsissubsp. israe知化iis，簡稱化i)產(chǎn)生的毒素蛋白對蚊蟲具有很好殺蟲活性，被廣泛用于蚊蟲的防 治。同時，分?蛋白具有溶細胞性，對某些Cjt蛋白具有增效作用及延緩昆蟲的抗性。
[0005]W化殺蟲晶體蛋白為基礎(chǔ)的殺蟲劑的使用已有50多年的歷史，最初一直沒有 檢測到昆蟲對化的抗性，但是，上世紀80年中期開始，抗性問題不斷在實驗室及田間試 驗中得到證實（McGau曲巧，W.H. 1985.Science. 229:193-195)，原因主要是持續(xù)使用 單品種及亞致劑量的化W及化轉(zhuǎn)基因抗蟲植物的應(yīng)用造成昆蟲種群長期受到殺蟲劑的 選擇壓力。1985年，McGau曲巧報道倉庫谷物害蟲印度谷頓(/7〇扣3in妃 在Dipel度tsubsp.左化nsiai左皿-1的商品制劑）的選擇壓力下，繁殖15代后，抗性增 加97倍；在高劑量選擇壓力下，抗性可增加250倍。1990年，在夏威夷首次證實大田中 的小菜蛾對化殺蟲劑產(chǎn)生了明顯的抗性（T油ashnA,B.E. ,eiai. 1994.Proc.化tl. Acad. Sci. USA.91:4120-4124),上世紀90年代W來，在我國應(yīng)用化殺蟲劑時間較長的深 圳、廣州、上海等地，發(fā)現(xiàn)化殺蟲劑對小菜蛾防治效果明顯下降，意味著抗性已經(jīng)形成(馮 夏.1996.昆蟲學(xué)報，39 (3) :238-244;Hofte,比，1988.Appl.化viron. Microbiol. 54: 2010-2017)。目前發(fā)現(xiàn)在實驗室及田間至少有十幾種昆蟲對化及其殺蟲晶體蛋白產(chǎn) 生了抗性，用選擇壓力數(shù)學(xué)模型預(yù)測到，在Bt轉(zhuǎn)基因抗蟲植物選擇壓力的條件下，昆蟲將 會產(chǎn)生抗性（Schnepf, E.，et al.1998.Mol. Biol. Rev.65 (3):77 5-806)。另外， 有研究證明Bti在大田的使用中尚未發(fā)現(xiàn)抗性問題，但是蚊蟲對其抗性問題不斷在實 驗室中得到證實，送種情況也可能會在大田中出現(xiàn)（Geor曲iou GP, 1997.Applied and Environmental Microbiology,63: 1095-1101.)。
[0006] 為避免抗性昆蟲所造成的損失，尋找新的高毒力化基因資源是解決送個問題的 有效途徑，送對我國的生物防治有著十分重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的第一個目的在于針對上述不足提供一種新的化毒力蛋白資源。
[000引本發(fā)明的第二個目的在于提供編碼所述蛋白的基因。
[0009] 本發(fā)明的第Η個目的在于提供上述蛋白及基因的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明從四川省成都市地區(qū)±壤中分離得到的蘇云金芽抱桿菌新菌株ΒΝ23-5， 該菌株已于2014年07月14日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中必(簡稱 CGMCC，地址；北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101) 保藏，分類命名為蘇云金芽抱桿菌(《acinusiAyrin知eftsis),保藏號為CGMCCNo. 9448。
[0011] 通過對BN23-5的毒力測試表明，BN23-5對鱗翅目害蟲等具有極高的毒力。根 據(jù)C1T7/類基因保守序列設(shè)計一對特異引物，擴增其基因組DNA，結(jié)果表明該菌株中存在 心片/類基因，進一步設(shè)計其全長基因引物，克隆得到知基因，其核巧酸序列如 序列表SEQIDNo. 1所示，全長為2160bp，分析表明，GC含量為36. 81%，編碼720個氨基酸組 成的蛋白。經(jīng)測定，其氨基酸序列如SEQIDNo. 2所示。在sof憂erry網(wǎng)站采用bacterial sigma7. 0promoter程序?qū)θ蛄羞M行預(yù)測表明，在基因編碼區(qū)上游含有RNA聚合酶活化 位點的序列，將其命名為蛋白的氨基酸組成如表1。
[0012]
[001引應(yīng)當理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明公開的蛋白CrW/eS斯氨基酸序列（SEQ IDNo. 2)，在不影響其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一個或幾個氨基酸，得到所述蛋 白的突變序列。例如在非活性區(qū)段，將第44位的Lys替換為Arg，或者將第713位的Leu替 換為lie,而不影響其活性。因此，本發(fā)明的化蛋白還包括SEQ ID No. 2所示氨基 酸序列經(jīng)取代、替換和/或增加一個或幾個氨基酸，具有與化蛋白同等活性的由 衍生得到的蛋白質(zhì)。
[0014] 本發(fā)明基因包括編碼所述蛋白斯核巧酸序列。
[0015] 本發(fā)明提供了編碼上述化蛋白的基因，其核巧酸序列為： (1)序列表SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列，或 (2) SEQ ID No. 1所示核巧酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或幾個核巧酸。
[0016] 此外，應(yīng)理解，考慮到密碼子的簡并性W及不同物種密碼子的偏愛性，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可W根據(jù)需要使用適合特定物種表達的密碼子。
[0017] 本發(fā)明的基因和蛋白質(zhì)可W從化菌株BN23-5中克隆或分離得到，或者通過DNA 或膚合成的方法得到。
[0018] 可將本發(fā)明基因與表達載體可操作地連接，得到能夠表達本發(fā)明蛋白的重組表達 載體，進而可W通過諸如農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、花粉管通道法等轉(zhuǎn)基因方法，將所述表 達載體導(dǎo)入宿主，得到轉(zhuǎn)CfW/eS基因的轉(zhuǎn)化體，例如農(nóng)作物或者果樹等植物，使其具備抗 蟲活性。
[0019] 在本發(fā)明的一個實施例中，化蛋白重組表達載體的獲得是通過將 基因插入到表達載體祀T-28a(+)上構(gòu)建得到重組表達載體祀T-1I。
[0020] 此外，還可W通過發(fā)酵本發(fā)明菌株BN23-5,得到含有蛋白的發(fā)酵液，將其 制備成殺蟲劑，用于農(nóng)作物害蟲的防治。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可W將上述基因轉(zhuǎn)化細菌或真 菌，通過大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)本發(fā)明化蛋白。
[0021] 本發(fā)明還提供了化蛋白在提高植物抗蟲性中的應(yīng)用。
[0022] 本發(fā)明提供了化蛋白在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
[0023] 本領(lǐng)域技術(shù)人員還可W根據(jù)本發(fā)明公開的基因，將其轉(zhuǎn)化棉花、玉米、水 稻、蔬菜等農(nóng)作物，使其具備相應(yīng)的抗蟲活性。例如；利用密碼子的簡并性，將Cr片/65基因