一種低溫乙醇法去除人免疫球蛋白熱原質(zhì)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物制藥領(lǐng)域，特別是一種低溫乙醇法去除人免疫球蛋白熱原質(zhì)的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 熱原（pyrogen)系指能引起恒溫動(dòng)物體溫異常升高的致熱物質(zhì)，廣義的熱原包括 細(xì)菌性熱原、內(nèi)源性高分子熱原、內(nèi)源性低分子熱原及化學(xué)熱原等，藥劑學(xué)上的"熱原"通常 是指細(xì)菌性熱原，是微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。大多數(shù)細(xì)菌、許多霉菌甚至病毒都能產(chǎn)生熱 原，致熱能力最強(qiáng)的是革蘭陰性桿菌所產(chǎn)生的熱原。內(nèi)毒素是產(chǎn)生熱原的最主要致熱物質(zhì)。 內(nèi)毒素由憐脂、脂多糖和蛋白質(zhì)所組成的復(fù)合物，其中脂多糖是內(nèi)毒素的主要成分，具有特 別強(qiáng)的致熱活性，一般脂多糖的分子量越大其致熱作用越強(qiáng)。含有熱原的注射劑，特別是輸 液注入人體后，大約半小時(shí)后，就會(huì)使人體產(chǎn)生發(fā)冷、寒戰(zhàn)、體溫升高、身痛、發(fā)汗、惡屯、嘔吐 等不良反應(yīng)，有時(shí)體溫可升至40°C左右，嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)昏迷、虛脫，甚至危及生命，臨床上稱 上述現(xiàn)象為"熱原反應(yīng)"，所W在各國藥典中熱原檢查是注射劑必檢的項(xiàng)目。
[0003] 在目前盡管GMP管理日益強(qiáng)化，但熱原污染然是生產(chǎn)企業(yè)的所面臨的一大關(guān)口。 一旦制品污染造成的損失是巨大的，故在血液制品生產(chǎn)過程中，強(qiáng)化無熱原操作一直是生 產(chǎn)企業(yè)培訓(xùn)的重點(diǎn)，總的來說熱原污染的渠道，無外乎W下幾種：原材料血漿、反應(yīng)容器、所 添加試劑、人工操作和工作環(huán)境。公開報(bào)道去除熱原的方法有活性炭吸附法，離子交換法， 超濾法，酸堿處理法等等。但運(yùn)些方法或多或少有些不足，比如活性炭吸附法，加入的過程 中會(huì)潛在的污染凈化車間，如大量加入會(huì)造成目標(biāo)蛋白的損失。離子交換法，受到處理批量 的限制。超濾法僅對分子量小的產(chǎn)品適用，不能滿足實(shí)際生產(chǎn)中的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種低溫乙醇法 去除人免疫球蛋白熱原質(zhì)的方法，可有效解決去除人免疫球蛋白熱原質(zhì)，W滿足對人免疫 球蛋白的需要問題。
[0005] 本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，基于低溫乙醇法采用體積濃度15%的乙醇沉淀，去除 熱原質(zhì)，步驟如下： (1) 、將熱原不合格的人免疫球蛋白制品用〇°C生理鹽水稀釋至20g/l，按每100kg熱原 不合格的人免疫球蛋白加入組分I+III或組分III沉淀40-50Kg，攬拌溶解，用抑4. 0的醋 酸鹽緩沖液調(diào)整溶液抑值至5. 15-5. 25,開啟冷媒系統(tǒng)將溶液降溫至0°C±0. 05°C，再加 入-15°CW下的體積濃度95%的乙醇至含醇量體積濃度為15%，乙醇加入速度《70LA，乙醇 加畢復(fù)測溶液抑值應(yīng)在5. 15-5. 25,否則用抑4. 0的醋酸鹽緩沖液調(diào)整至抑5. 15-5. 25， 邊加乙醇邊降溫至-4. 0°C±0. 5°C; (2) 、向降溫后的溶液中加入娃藻±，每lOOOL降溫后的制品中加入娃藻± 15Kg，攬拌 30分鐘，用壓濾機(jī)進(jìn)行第一次壓濾，壓濾過程中工作壓力控制在0. 2MPa之內(nèi)，濾液溫度控 制在-2. 5~-4. 5°C，每30分鐘檢查一次濾液的溫度和澄明度，壓濾結(jié)束后用冷壓縮空氣吹 盡壓濾機(jī)腔內(nèi)液體，再累入-4.(TC±0. 5°C的體積濃度為15%平衡液沖洗壓濾機(jī)，每臺(tái)壓濾 機(jī)平衡液沖洗用量是150~200L，再用冷壓縮空氣吹盡壓濾機(jī)腔內(nèi)的平衡液，收集含有平衡 液的濾液，得組分III壓濾液，棄去沉淀； 所述的娃藻上先180°C干烤2.5小時(shí)，再降溫至0°(：^下使用； 所述的體積濃度為15%平衡液的制備方法是，每lOOmL平衡液中含體積濃度乙醇 15〇/〇、憐酸氨二鋼0. 005mol/L，用2mol/L冰乙酸調(diào)整抑值至5. 20±0. 05,溶液溫度溫 度-4.(TC±0. 5°C; 所述的壓濾機(jī)在使用前，先安裝濾板，每lOOKg人免疫球蛋白裝25張濾板，采用注射用 水沖洗壓濾機(jī)至細(xì)菌內(nèi)毒素為陰性，每50化的15%平衡液中加入娃藻±4Kg，攬拌后將其累 入壓濾機(jī)進(jìn)行循環(huán)冷卻，壓濾機(jī)出口溫度到-3°CW下時(shí)，停止循環(huán)，-3°CW下的壓縮空氣將 壓濾機(jī)吹干備用； (3) 、組分II沉淀的制備 ① 、計(jì)量組分III壓濾液體積，按5g/L量加入氯化鋼，WImol/L碳酸氨鋼調(diào)整溶液抑 值至7. 10 + 0. 10,加入-15°CW下的體積濃度95%的乙醇至組分III壓濾液中使乙醇終體 積濃度為19%，降溫至-6. 0~-7. (TC，攬拌反應(yīng)2小時(shí)W上進(jìn)行第二次壓濾； ② 、第二次壓濾：壓濾的過程中，工作壓力控制在〇.2MPa之內(nèi)，濾液溫度控制 在-6.(TC±0. 5°C，每30分鐘檢查一次濾液的溫度和澄明度，壓濾結(jié)束后用-3°CW下壓縮 空氣吹盡壓濾機(jī)腔內(nèi)液體，累入-6.(TC±0. 5°C的體積濃度19%平衡液20化沖洗壓濾機(jī)， 再用-3°CW下壓縮空氣吹盡壓濾機(jī)腔內(nèi)液體，并繼續(xù)吹30分鐘后收集沉淀，即組分II沉 淀，棄去上清液； 所述的19%平衡液配制：每lOOmL平衡液中含體積濃度乙醇19%、憐酸氨二鋼 0. 005mol/L、氯化鋼 4g/L，用 2mol/L冰乙酸調(diào)整抑 7. 10 + 0. 10,溫度為-6. 0°C±0. 5°C; 所述的壓濾機(jī)在第二次壓濾前，先安裝濾板，每lOOKg人免疫球蛋白裝25張濾板，用注 射用水沖洗壓濾機(jī)至細(xì)菌內(nèi)毒素為陰性，每50化的19%平衡液中加入娃藻± 5-6Kg，攬拌后 將其累入壓濾機(jī)進(jìn)行循環(huán)冷卻，壓濾機(jī)出口溫度到-4°CW下時(shí)停止循環(huán)，-3°CW下的壓縮 空氣將壓濾機(jī)吹干備用； (4) 、組分II沉淀的溶解及過濾 用4~5倍沉淀重量的0°C注射用水溶解組分II沉淀，W2mol/LHAc調(diào)節(jié)溶解液抑值 到3. 80~4. 10,溶解4小時(shí)W上靜置過濾，過濾結(jié)束，用0°C注射用水沖洗板框，沖洗液并 入到過濾液中； (5) 、超濾 將過濾液打入超濾罐內(nèi)，用0~4°C透析水等體積透析9遍后濃縮至蛋白濃度60~ 80邑/1，再用注射用水稀釋至51g/l，添加麥芽糖至麥芽糖的最終含量為90-110g/l，用 2mol/LHAc調(diào)節(jié)溶液抑值3. 80~4. 10,再進(jìn)行病毒滅活，除菌分裝后即為去除熱原質(zhì)的 人免疫球蛋白制品。
[0006] 本發(fā)明方法科學(xué)先進(jìn)，易操作，效果好，可有效的去除人免疫球蛋白制品中熱原 質(zhì)，變廢為寶，減少環(huán)境污染，經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益巨大。
【附圖說明】
[0007] 圖1為本發(fā)明的工藝流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0008]W下結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說明。
[0009] 實(shí)施例1 本發(fā)明在具體實(shí)施中，可由W下方法實(shí)現(xiàn)： (1) 、將熱原不合格的人免疫球蛋白制品用〇°C生理鹽水稀釋至20g/l，按每100kg熱原 不合格的人免疫球蛋白加入組分I+III或組分ΙΠ沉淀40Kg，攬拌溶解，用抑4. 0的醋酸鹽緩 沖液調(diào)整溶液抑值至5. 2,開啟冷媒系統(tǒng)將溶液降溫至(TC±0. 05°C，再加入-15°CW下的 體積濃度95%乙醇至含醇量體積濃度為15%，乙醇加入速度《70LA，用pH4. 0的醋酸鹽緩 沖液調(diào)整溶液抑值至5. 2,邊加乙醇邊降溫至-4.(TC±0. 5°C，得降溫后的制品； (2) 、向降溫后的溶液中加入娃藻±，每1000L降溫后的制品中加入娃藻± 15Kg，攬拌 30分鐘，用壓濾機(jī)進(jìn)行第一次壓濾，壓濾過程中工作壓力控制在0. 2MPa之內(nèi)，濾液溫度控 制在-4. 0°C±0. 5°C，每30分鐘檢查一次濾液的溫度和澄明度，壓濾結(jié)束后用冷壓縮空氣 吹盡壓濾機(jī)腔內(nèi)液體，再累入-4.(TC±0. 5°C的體積濃度為15%平衡液沖洗壓濾機(jī)，每臺(tái)壓 濾機(jī)平衡液沖洗用量是150~200L，再用冷壓縮空氣吹盡壓濾機(jī)腔內(nèi)的平衡液，收集含有平 衡液的濾液，得組分III壓濾液，棄去沉淀； 所述的壓濾機(jī)在使用前，先安裝濾板，每lOOKg人免疫球蛋白裝25張濾板，采用注射用 水沖洗壓濾機(jī)至細(xì)菌內(nèi)毒素為陰性，每50化的15%平衡液中加入娃藻±4Kg，攬拌后將其累 入壓濾機(jī)進(jìn)行循環(huán)冷卻，壓濾機(jī)出口溫度到-3°CW下時(shí)，停止循環(huán)，-3°CW下的壓縮空氣將 壓濾機(jī)吹干備用； (3) 、組分II沉淀的制備 ① 、計(jì)量組分III壓濾液體積，按5g/L量加入氯化鋼，WImol/L碳酸氨鋼調(diào)整溶液抑 值7. 10 + 0. 10,加入-15°CW下的95%乙醇至組分III壓濾液中乙醇體積濃度為19%，降溫 至-6.0~-7. 0°C，攬拌反應(yīng)2小時(shí)W上； ② 、第二次壓濾：第二次壓濾前先在壓濾機(jī)上安裝濾板，每lOOKg人免疫球蛋白裝25 張濾板，用注射用水沖洗壓濾機(jī)至細(xì)菌內(nèi)毒素為陰性，每50化的19%平衡液中加入娃藻 ± 5-服g，攬拌后將其累入壓濾機(jī)進(jìn)行循環(huán)冷卻，壓濾機(jī)出口溫度到-4°CW下時(shí)停止循 環(huán)，-3°CW下的壓縮空氣將壓濾機(jī)吹干備用； 壓濾的過程中，工作壓力控制在0. 2MPa之內(nèi)，濾液溫度控制在-6. 0°C±0. 5°C，每30 分鐘檢查一次濾液的溫度和澄明度，壓濾結(jié)束后用-3°CW下壓縮空氣吹盡壓濾機(jī)腔內(nèi)液 體，累入-6.(TC±0. 5°C的體積濃度19%平衡液20化沖洗壓濾機(jī)，再用-3°CW下壓縮空氣 吹盡壓濾機(jī)腔內(nèi)液體，并繼續(xù)吹30分鐘后收集沉淀，即組分II沉淀，棄去上清液； (4) 、組分II沉淀的溶解及過濾 用4~5倍沉淀重量的0°C注射用水溶解組分II沉淀，2mol/LHAc調(diào)節(jié)抑值到3. 9,溶 解4小時(shí)W上靜置過濾，過濾結(jié)束，用0°C注射用水沖洗板框，沖洗液并入到過濾液中； (5) 、超濾 將過濾液打入超濾罐內(nèi)，用0~4°C透析水等體積透析9遍后濃縮至蛋白濃度60~ 80g/l，再用注射用水稀釋至質(zhì)量濃度5. 1%，添加麥芽糖至麥芽糖的最終含量為90-110g/L，2mol/LHAc調(diào)節(jié)抑3. 90,再進(jìn)行病毒滅活，即為去除熱原質(zhì)的人免疫球蛋白制品。
[0010] 實(shí)施例2 本發(fā)明在具體實(shí)施中，也可由W下方法實(shí)現(xiàn)： (1) 、將熱原不合格的人免疫球蛋白制品用〇°C生理鹽水稀釋至20g/l，按每100kg熱 原不合格的人免疫球蛋白加入組分I+III或組分ΙΠ沉淀50Kg，攬拌溶解，用抑值4. 0的醋 酸鹽緩沖液調(diào)整溶液抑值至5. 25,開啟冷媒系統(tǒng)將抑調(diào)整液降溫至0°C±0. 05°C，再加 入-15°CW下的體積濃度95%乙醇至含醇量體積濃度為15%，乙醇加入速度《70LA，用抑 值4. 0的醋酸鹽緩沖液調(diào)整溶液抑值至5. 25,邊加乙醇邊降溫至-4.(TC±0. 5°C，得降溫 后的制品； (2) 、向降溫后的制品中加入娃藻±，每1000L降溫后的制品中加入娃藻± 15Kg， 攬拌30分鐘，用壓濾機(jī)進(jìn)行第一次壓濾，工作壓力控制在0. 2MPa之內(nèi)，濾液溫度控制 在-3~-4°C，每30分鐘檢查一次濾液的溫度和澄明度，壓濾結(jié)束后用冷壓縮空氣吹盡壓濾 機(jī)腔內(nèi)液體，再累入