一種酵母乙醇提取物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種酵母乙醇提取物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、輕工業(yè)和醫(yī)學(xué)研究與生產(chǎn)的每種微生物都需要在合適的營養(yǎng)才能生長，除需要碳源、氮源、無機(jī)鹽和水外，還需要各種生長因子，因而，開發(fā)一種適用于各種微生物快速生長的添加劑對微生物工業(yè)生產(chǎn)具有舉足輕重的作用。
[0003]現(xiàn)有工藝中，所提到酵母抽提物，是以蛋白質(zhì)含量豐富的酵母為原料，在破壁后，經(jīng)生物酶解和加熱等方法獲得，因采用了酶解及加熱方法等手段，破壞了對菌體有用的活性成分，雖然常作為微生物發(fā)酵培養(yǎng)機(jī)的成分之一，但主要解決了培養(yǎng)基的氮源問題。
[0004]另外，在促進(jìn)蛋白的表達(dá)方面，常用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作為誘導(dǎo)劑，然而，IPTG具有一定的缺陷，一是對微生物有毒副作用，抑制菌體生長，從而影響蛋白的表達(dá)量，二是IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)過快，對蛋白的表達(dá)后折疊不利，容易形成包涵體；三是IPTG不可以通過代謝清除，有殘留且有一定潛在毒性，不適合在工業(yè)化大生產(chǎn)中生產(chǎn)用于人的基因工程藥物，目前，雖然也有單獨(dú)通過添加如谷氨酰胺、精氨酸或乳糖到培養(yǎng)基中，但總體效果不是十分理想，因而總的來說，國內(nèi)外沒有一種效果顯著的細(xì)菌生長及蛋白表達(dá)促進(jìn)劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種酵母乙醇提取物，相對于傳統(tǒng)方法制備的酵母提取物，條件更溫和，得到的活性成分更高。
[0006]為了解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是這樣的，一種酵母乙醇提取物，由以下方法制備而得，酵母經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后，對菌體進(jìn)行收集，菌體經(jīng)機(jī)械破壁處理后，上清液用乙醇沉淀，使上清液中乙醇的濃度為70V%，分離得到沉淀物即為酵母乙醇提取物。。
[0007]本發(fā)明的酵母乙醇提取物，是以蛋白質(zhì)含量豐富的酵母為原料，經(jīng)破壁后，將其中水溶性的肽、核苷酸、各種糖、氨基酸、維生素等經(jīng)溫和的乙醇進(jìn)行抽提，提取物添加到傳統(tǒng)的發(fā)酵培養(yǎng)過程中作為微生物生物發(fā)酵的蛋白表達(dá)及生長促進(jìn)劑，結(jié)果表明該提取物能夠強(qiáng)力促進(jìn)細(xì)菌生長及蛋白表達(dá)，相對于傳統(tǒng)的本酵母提取物來說，能更好地促進(jìn)微生物生長及促進(jìn)工程菌的蛋白的合成的原因是因本發(fā)明采用了溫和的乙醇提取方法，沒有通過加熱等傳統(tǒng)方法，獲得的酵母提取物中的各種活性成分明顯高于傳統(tǒng)方法制備的酵母提取物。
[0008]經(jīng)檢測，本發(fā)明的酵母乙醇提取物中富含煙酰胺、煙酸、谷胱甘肽、氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)及其他核苷酸、6-磷酸果糖、1，6-二磷酸果糖、3-磷酸甘油醛、各種小肽、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、絲氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、蘇氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸和組氨酸二十種氨基酸、各種維生素及微量元素等多種具有促進(jìn)微生物生長及蛋白快速合成的促進(jìn)因子。
[0009]本發(fā)明還提供了一種促進(jìn)基因工程菌外源蛋白表達(dá)的復(fù)配劑，由上述的酵母乙醇提取物和乳糖按重量比1-15:1復(fù)配而成。
[0010]進(jìn)一步優(yōu)化后，其中，酵母乙醇提取物和乳糖優(yōu)選地按重量比5:1復(fù)配而成。
[0011]本發(fā)明的復(fù)配劑兼有誘導(dǎo)蛋白表達(dá)和促進(jìn)蛋白合成的雙重作用，能夠替代IPTG作為誘導(dǎo)劑來誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)，與IPTG作為誘導(dǎo)劑相比，具有如下優(yōu)點(diǎn):1、成分全部為天然、無毒的食品級物質(zhì)，能夠被微生物完全利用，不會有毒性殘留；2、能夠促進(jìn)微生物的生長，誘導(dǎo)后的0D600比利用IPTG作為誘導(dǎo)劑時(shí)提高3倍以上；3、蛋白的表達(dá)量與利用IPTG作為誘導(dǎo)劑相比提高了 50-400%，且表達(dá)的蛋白可溶性好、包涵體少；4、價(jià)格低廉，大大降低工業(yè)生產(chǎn)和實(shí)驗(yàn)研究的成本。
[0012]本發(fā)明還提供了一種促進(jìn)微生物生長的方法，在微生物發(fā)酵時(shí)，添加上述的酵母乙醇提取物。
[0013]為了更好地促進(jìn)生物生長，在微生物發(fā)酵8-18小時(shí)后，添加上述的酵母乙醇提取物。
[0014]優(yōu)選地，酵母乙醇提取物添加量為0.5-5 g/100mL，
進(jìn)一步優(yōu)化后，酵母乙醇提取物添加量優(yōu)選地為1.25 g/100mL。
[0015]上述的酵母乙醇提取物可以對各種微生物，包括大腸桿菌、枯草桿菌、谷氨酸棒桿菌及其相應(yīng)工程菌的生長具有促進(jìn)作用，具體包括以下步驟:
1)將滅菌后的LB培養(yǎng)基或M9培養(yǎng)基接入需要培養(yǎng)的菌種；
2)培養(yǎng)8-18小時(shí)后加入上述的酵母乙醇提取物，使發(fā)酵液中酵母乙醇提取物的濃度為 1.25 g/100mL ；
3)繼續(xù)培養(yǎng)6h；
經(jīng)測定，與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法未加入酵母乙醇提取物相比，菌體量提高了 3-10倍。
[0016]本發(fā)明還一種促進(jìn)基因工程菌外源蛋白表達(dá)的方法，在工程菌發(fā)酵培養(yǎng)至菌體達(dá)到對數(shù)生長期后，向發(fā)酵液中加入上述的復(fù)配劑，使發(fā)酵液中復(fù)配劑的濃度為1.25g/100mL，繼續(xù)培養(yǎng)3-8h，即可。
[0017]上述的復(fù)配劑用于促進(jìn)基因工程菌外源蛋白表達(dá)的方法，具體包括以下步驟:
1)將滅菌后的LB培養(yǎng)基或M9培養(yǎng)基接入需要培養(yǎng)的基因工程菌菌種；
2)當(dāng)培養(yǎng)的菌體達(dá)到對數(shù)生長期后加入上述的復(fù)配劑，使發(fā)酵液中復(fù)配劑的濃度為1.25 g/100 mL ；
3)繼續(xù)培養(yǎng)3-8h。
[0018]經(jīng)測定，與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法加入IPTG相比，菌體量提高了 3-10倍，SDS-PAGE鑒定蛋白表達(dá)效果發(fā)現(xiàn)，被誘導(dǎo)的蛋白量也得到明顯的增加。
[0019]有益效果:
1、本發(fā)明的酵母乙醇提取物，相對于傳統(tǒng)方法制備的酵母提取物，條件更溫和，得到的活性成分更高。
[0020]2、本發(fā)明的酵母乙醇提取物對各種微生物及基因工程菌的生長有明顯的促進(jìn)作用。
[0021]3、本發(fā)明的酵母的乙醇提取物除了能促進(jìn)微生物快速生長外，許多活性成分能夠?yàn)榈鞍缀铣商峁┏浞值哪芰咳鏏TP等，使異源蛋白合成加快，因而酵母的乙醇提取物與乳糖的聯(lián)合使用兼有誘導(dǎo)蛋白表達(dá)和促進(jìn)蛋白合成的雙重作用，達(dá)到高效誘導(dǎo)表達(dá)的目的，相對于單獨(dú)用乳糖作為誘導(dǎo)劑相比，效率更高，特別是該提取物與乳糖聯(lián)合使用，在基因工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)方面能有效替代異丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG )作為誘導(dǎo)劑使用，且誘導(dǎo)效果明顯優(yōu)于IPTG，另外，由于采用的是生物來源的活性物質(zhì)，誘導(dǎo)后能夠完全被微生物利用，沒有任何殘留，對藥品中無IPTG殘留的制藥行業(yè)具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0022]4、本發(fā)明的酵母乙醇提取物和復(fù)配劑生產(chǎn)成本低廉，易操作，易放大，穩(wěn)定性好，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，為微生物工程菌的生長的促進(jìn)和蛋白誘導(dǎo)表達(dá)提供了新的方法。
【附圖說明】
[0023]圖1是含醛縮酶(Aid)的大腸桿菌工程菌的搖床誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果比較圖，其中，1為加IPTG的蛋白表達(dá)情況，2-4為加復(fù)配劑的蛋白表達(dá)情況；
圖2是ω轉(zhuǎn)氨酶在5升發(fā)酵罐體系中的表達(dá)結(jié)果比較圖，其中，1為總蛋白，2為上清，Α為加IPTG誘導(dǎo)6小時(shí)的蛋白表達(dá)情況，B為加復(fù)配劑誘導(dǎo)4小時(shí)的蛋白表達(dá)情況，C為加復(fù)配劑誘導(dǎo)5小時(shí)的蛋白表達(dá)情況，D為加復(fù)配劑誘導(dǎo)6小時(shí)的蛋白表達(dá)情況；
圖3是綠色熒光蛋白GFP在5升發(fā)酵罐體系中的表達(dá)結(jié)果比較圖，其中，1為加IPTG的蛋白表達(dá)情況，2為加IPTG的蛋白表達(dá)情況，A為誘導(dǎo)3h，B為誘導(dǎo)4.5h，C為誘導(dǎo)6h，D為誘導(dǎo)8h。
【具體實(shí)施方式】