一種雞新城疫、禽流感特異性病毒稀釋液及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于獸用生物制品技術領域，具體設及一種雞新城疫、禽流感特異性病毒 稀釋液及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 新城疫和禽流感是當今全球范圍內最流行的家禽傳染病，也是我國所有雞病中危 害最大的兩種疾病。二聯(lián)疫苗的制備，可W-針防治兩種傳染病，同時可W解決使用多種疫 苗分次免疫，造成的雞群的其它的不良反應，簡化免疫程序，降低投入的成本。當前國內生 產的新城疫、禽流感二聯(lián)滅活疫苗基本都是采用雞胚接種病毒后進行增殖，收獲尿囊液制 備而成。傳統(tǒng)的二聯(lián)疫苗均由單一疫苗分別生產后混合在一起制成二聯(lián)疫苗，該工藝費時 費力，生產成本較高。同胚培養(yǎng)是近年來獸用生物制品行業(yè)提出的生產工藝，即將兩種病毒 W合適的比例混合后同時接種到雞胚中進行增殖，該工藝減少了生產工藝環(huán)節(jié)，縮短的生 產周期，減少人力物力投入，大大降低了生產成本。但是截至到目前為止同胚培養(yǎng)的工藝仍 存在缺陷，特別是雞新城疫、禽流感的同胚培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中由于病毒之間的互相干擾，兩 種病毒的含量均不穩(wěn)定，批次間差異較大，困擾著該品種的生產，嚴重影響了后期疫苗的品 質。
[0003] 因此，研發(fā)一種雞新城疫、禽流感特異性病毒稀釋液勢在必行。

【發(fā)明內容】

[0004]針對現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明的目的在于設計提供一種雞新城疫、禽流感特 異性病毒稀釋液及其制備方法的技術方案。
[0005]所述的一種雞新城疫、禽流感特異性病毒稀釋液，其特征在于所述的雞新城疫、禽 流感特異性病毒稀釋液每1000ml憐酸緩沖液中含有W下重量配比的組分：氨基酸組合2~ 4g、維生素組合3~6g、亞砸酸鋼0~lOmg和復方中藥多糖20~50g; 所述的氨基酸組合包括天冬氨酸、脯氨酸和谷氨酷胺； 所述的維生素組合包括維生素B1、維生素B3和維生素B7 ; 所述的復方中藥多糖由海藻、地膚子、桑葉、牽牛子和丹參提取得到。
[0006]所述的一種雞新城疫、禽流感特異性病毒稀釋液，其特征在于該稀釋液的抑為 7. 0 ~7. 2。
[0007]所述的一種雞新城疫、禽流感特異性病毒稀釋液，其特征在于所述的憐酸緩沖液 由氯化鋼6~lOg，氯化鐘0. 05~0. 5g，憐酸氨二鋼1~1. 2g，憐酸二氨鐘0. 05~0. 5邑， 氯化巧0. 05~0. 2g，含6個結晶水的氯化儀0. 05~0. 2g溶于1000ml雙蒸水中得到。
[0008]所述的一種雞新城疫、禽流感特異性病毒稀釋液，其特征在于所述的氨基酸組合 中含有：天冬氨酸20~50%、脯氨酸20~40%和谷氨酷胺10~60%，優(yōu)選為天冬氨酸30~ 40%、脯氨酸25~35%和谷氨酷胺30~40%。
[0009]所述的一種雞新城疫、禽流感特異性病毒稀釋液，其特征在于所述的維生素組合 中含有：維生素B1 15~35%、維生素B3 20~50%和維生素B7 20~50%，優(yōu)選為維生素B1 20~30%、維生素B3 30~40%和維生素B7 35~45〇/〇。
[0010] 所述的一種雞新城疫、禽流感特異性病毒稀釋液，其特征在于所述的復方中藥多 糖按W下步驟制得： a、 按海藻20~40份、地膚子5~20份、桑葉10~30份、牽牛子5~20份和丹參10~ 30份稱取各中藥原料，切碎、洗凈后用冷水浸泡過夜，再加入原料重量15倍的純化水，水浴 至90°C，并保持在90°C，熬制2小時，熬制過程中每10分鐘攬拌一次； b、 棄去a中藥渣，收集藥液，室溫冷卻后經(jīng)1000化pm離屯、10分鐘，棄去沉淀，收集上 清； C、將b中上清進行醇沉，沉淀得到粗制中藥多糖； t用滅菌純化水洗涂C中粗制中藥多糖，洗涂后用20倍量的42°C滅菌純化水進行溶 解，溶解后，按0. 5%比例加入活性炭4°C吸附過夜，吸附后經(jīng)1000化pm離屯、10分鐘，棄去沉 淀，收集上清； e、 將d中上清液進行10倍濃縮，制得中藥多糖濃縮液； f、 將e中中藥多糖濃縮液進行真空冷凍干燥制得復合中藥多糖凍干粉。
[0011] 所述的一種雞新城疫、禽流感特異性病毒稀釋液的制備方法，其特征在于通過W 下步驟制得： 1) 憐酸緩沖溶液的配制：按比例稱取氯化鋼、氯化鐘、憐酸氨二鋼、憐酸二氨鐘、氯化 巧、含6個結晶水的氯化儀溶于雙蒸水中，無菌條件下通過0. 22μm濾膜，過濾除菌備用； 2) 復方中藥多糖的制備 a、 按比例稱取海藻、地膚子、桑葉、牽牛子和丹參，切碎、洗凈后用冷水浸泡過夜，再加 入原料重量15倍的純化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小時，熬制過程中每10分 鐘攬拌一次； b、 棄去a中藥渣，收集藥液，室溫冷卻后經(jīng)1000化pm離屯、10分鐘，棄去沉淀，收集上 清； C、將b中上清進行醇沉，沉淀得到粗制中藥多糖； t用滅菌純化水洗涂C中粗制中藥多糖，洗涂后用20倍量的42°C滅菌純化水進行溶 解，溶解后，按0. 5%比例加入活性炭4°C吸附過夜，吸附后經(jīng)1000化pm離屯、10分鐘，棄去沉 淀，收集上清； e、 將d中上清液進行10倍濃縮，制得中藥多糖濃縮液； f、 將e中中藥多糖濃縮液進行真空冷凍干燥制得復合中藥多糖凍干粉； 3) 接種雞胚用病毒稀釋液配制：按比例稱取氨基酸組合、維生素組合、復方中藥多糖和 亞砸酸鋼，溶解于步驟1)制得的憐酸緩沖溶液中，充分混勻，用酸或堿調節(jié)抑至6. 6~7. 0 之間，無菌條件下通過0. 22μm濾膜，過濾除菌后置4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0012] 本發(fā)明的有益效果是： (1)本發(fā)明所制備的稀釋液，可接種低日齡雞胚，因低日齡雞胚組織分化程度較低，與 現(xiàn)有技術相比，病毒更易在雞胚組織中增殖。
[0013] (2)本發(fā)明所制備的稀釋液接種雞胚后，可提高雞胚耐受病毒的能力，延長死亡時 間，即延長了病毒增殖時間，與現(xiàn)有技術相比提高了病毒滴度2~8倍。
[0014] (3)按本發(fā)明方法培養(yǎng)收獲的病毒液提高了同胚培養(yǎng)的穩(wěn)定性，大大降低了批次 間差異，為后續(xù)疫苗生產工藝提供了優(yōu)質的抗原液。
【具體實施方式】
[0015] 為了使本發(fā)明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解， 運些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[001引實施例1 一種雞新城疫、禽流感特異性病毒稀釋液，該病毒稀釋液每1000ml憐酸緩沖液中含 有：氨基酸組合3g(其中天冬氨酸0. 9g、脯氨酸0. 9g、谷氨酷胺1. 2g)、維生素組合5g(其 中維生素B1 1.5g、維生素B3 1.75g、維生素B7 1.75g)、復方中藥多糖40g、亞砸酸鋼4mg， 該稀釋液抑為7.0。
[0017] 一種雞新城疫、禽流感特異性病毒稀釋液的制備方法，其步驟是： (1)憐酸緩沖溶液的配制：按上述憐酸鹽緩沖液配方準確稱取氯化鋼8g，氯化鐘0. 2g， 憐酸氨二鋼1. 15g，憐酸二氨鐘0. 2g，氯化巧0.Ig，含6個結晶水的氯化儀0.Ig溶于1000ml 雙蒸水中，無菌條件下通過0. 22μm濾膜，過濾除菌備用。
[001引（2)復方中藥多糖的制備 a、按比例稱取所述中藥原料，切碎、洗凈后用冷水浸泡過夜，再加入原料重量15倍的 純化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小時，熬制過程中每10分鐘攬拌一次。
[0019]b、棄去a中藥渣，收集藥液，室溫冷卻后經(jīng)1000化pm離屯、10分鐘，棄去沉淀，收集 上清。
[0020] C、采用公知的醇沉法，將b中上清進行醇沉，沉淀為粗制中藥多糖。
[0021]t用滅菌純化水洗涂C中粗制多糖，洗涂后用20倍量的42°C滅菌純化水進行溶 解，溶解后，按0. 5%比例加入活性炭4°C吸附過夜，吸附后經(jīng)1000化pm離屯、10分鐘，棄去沉 淀，收集上清。
[0022] e、采用公知的真空減壓濃縮法，將d中上清液進行10倍濃縮，制得中藥多糖濃縮 液。
[0023]f、采用公知的真空冷凍干燥法，將e中藥多糖濃縮液進行真空冷凍干燥制得復合 中藥多糖凍干粉。
[0024] (3)接種雞胚用病毒稀釋液配制：按上述優(yōu)選稀釋液組分數(shù)準確稱取天冬氨酸 0. 9g、脯氨酸0. 9g、谷氨酷胺1.2g、維生素B1 1.5g、維生素B3 1.75g、維生素B7 1.75g、復 方中藥多糖40g，亞砸酸鋼4mg，按比例溶解于步驟（1)中的1000ml憐酸緩沖溶液中，充分 混勻，用酸或堿調節(jié)抑至7. 0,無菌條件下通過0. 22μm濾膜，過濾除菌后置4°C保存?zhèn)溆谩?[00幼實施例2 一種雞新城疫、禽流感特異性病毒稀釋液，該病毒稀釋液每1000ml憐酸緩沖液（由氯 化鋼lOg，氯化鐘0. 5g，憐酸氨二鋼1. 2g，憐酸二氨鐘0. 5g，氯化巧0. 2g，含6個結晶水的 氯化儀0. 2g溶于1000ml雙蒸水中得到）中含有：氨基酸組合4g(其中天冬氨酸2g、脯氨 酸0.8g、谷氨酷胺1.2g)、維生素組合6g(其中維生素B1 2. Ig、維生素B3 1.2g、維生素B7 2. 7g)、復方中藥多糖50g(由海藻20份、地膚子5份、桑葉10份、牽牛子5份和丹參10份 提取得到)、亞砸酸鋼2mg，該稀釋液抑為7. 0。
[0026] 一種雞新城疫、禽流感特異性病毒稀釋液的制備方法，其步驟同實施例1。
[0027] 實施例3 一種雞新城疫、禽流感特異性病毒稀釋液，該病毒稀釋液每1000ml憐酸緩沖液（由氯 化鋼6g，氯化鐘0. 05g，憐酸氨二鋼Ig，憐酸二氨鐘0. 05g，氯化巧0. 05g，含6個結晶水的 氯化儀0. 05g溶于1000ml雙蒸水中得到)中含有：氨基酸組合2g(其中天冬氨酸0. 4g、脯 氨酸〇.8g、谷氨酷胺0.8g)、維生素組合3g(其中維生素B1 0.45g、維生素B3 1.5g、維生素 B7 1. 05g)、復方中藥多糖20g(海藻40份、地膚子20份、桑葉30份、牽牛子20份和丹參30 份)、亞砸酸鋼lOmg，該稀釋液抑為7. 2。
[0028] 一種雞新城疫、禽流感特異性病毒稀釋液的制備方法，其步驟同實施例1。
[0029] 實施例4 :一種雞新城疫、禽流感同胚培養(yǎng)的方法，采用雞新城疫、禽流感特異性 病毒稀釋液稀釋新城疫病毒至1000-5000倍，稀釋禽流感病毒至5000-10000倍，分別在4°C 解育30-60分鐘后按1:1比例混合均勻，接種9-10日齡雞胚，0. 1-0. 15ml