50ml液體培養(yǎng)基。
[0045] 將積憐小月菌JN459菌株接種到上述液體培養(yǎng)基，25°C、200巧m搖床培養(yǎng)至對數(shù) 生長期，離屯、收集菌體，用4°C10%甘油洗涂3次，最后用4°C10%甘油稀釋至l〇s個/ml, 作為電擊轉化的感受態(tài)細胞。
[0046] 采用電擊轉化技術將重組PMV30服質(zhì)粒轉入積憐小月菌JN459菌株，在同源重組 作用下得到一系列轉化子，構建含ppk2基因啟動子突變體的菌株庫，一共獲得1035個重組 菌株，編號JN459-M1 至JN459-M1035。
[0047] 上述ppk2基因及其上下游的基因序列和基因位置為現(xiàn)有技術中已知的，記載在 KawakoshiA.，Nakazawa比，F(xiàn)ukadaJ.，SasagawaΜ.，KatanoY.，NakamuraS.，Hosoyama A.，Sasaki比，IchikawaN.，HanadaS.，KamagataY.，NakamuraK.，YamazakiS.，F(xiàn)ujita N. DecipheringthegenomeofpolyphosphateaccumulatingActinobacterium Microlunatusphosphovorus.DNAResearch. 2012, 19:383-394。重組穿梭載體pMV30服的 構建采用的方法均為通用的基因工程技術（如參考"基因工程原理和技術"，鄒克琴，浙江 大學出版社），為現(xiàn)有技術的常規(guī)技術手段。
[0048] 積麟小月菌JN459菌株記載在文獻"聚麟菌JN459的分離和聚麟特性研究."，鐘 傳青，姜天翼，王靜，張春明.山東建筑大學學報.201530 (1):25-28中。 W例實施例3 :突變菌株的聚憐活性篩選
[0050] 將實施例2構建的重組菌株用上述液體培養(yǎng)基（實施例2)培養(yǎng)至對數(shù)生長期， 離屯、收集菌體，并用無菌水洗涂、稀釋至l〇s個/ml,按5%接種量接種到新的上述液體培養(yǎng) 基，每個重組菌株接種一個50ml/250ml搖瓶。25°C、200巧m搖床培養(yǎng)48小時，吸取10ml菌 液，300化pm離屯、lOmin收集菌體，測定化ly-P含量。余下的培養(yǎng)液用無菌氮氣置換搖瓶 中空氣，然后密封瓶口，25°C、200巧m搖床繼續(xù)培養(yǎng)24小時，吸取10ml菌液，300化pm離屯、 lOmin收集菌體，測定化ly-P含量。結果見表1。
[0051] 結果顯示17株突變株在厭氧24小時后化ly-P含量顯著高于出發(fā)菌株JN459,其 中JN459-M571突變菌的化ly-P含量最高，達到8. 62%，說明運些突變株在厭氧條件下分解 化ly-P的能力下降。
[0052] 表1好氧和厭氧運行時化ly-P占細胞干重（％ )
[0053]
[0054] 實施例4 :積憐小月菌JN459-M571菌株的遺傳穩(wěn)定性考察 陽化5] 按下列配方配制固體培養(yǎng)基：葡萄糖0. 5g、蛋白腺0. 5g、酵母粉0. 5g、谷氨酸鋼 O. 5g、硫酸錠0.Ig、憐酸氨二鐘0. 44g、硫酸儀0.Ig、瓊脂粉20g、純化水lL，pH7. 0,0. 15MPa 滅菌30min。
[0056] 將JN459-M571菌株懸液稀釋涂布在固體培養(yǎng)基上25 °C培養(yǎng)7天，然后分離 JN459-M571的單菌落并進行擴大培養(yǎng)，依此方式連續(xù)傳代培養(yǎng)和分離單抱六次，并按照實 施例3的方法驗證聚憐活性，結果見表2,結果表明JN459-M571菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定 性，滿足邸PR生物除憐系統(tǒng)的需求。
[0057] 表2不同傳代次數(shù)的聚憐活性比較
[0058]
[0059] 實施例5:卵k2基因啟動子突變體的DNA序列測定
[0060] 提取工程菌JN459-M571的基因組DNA作為模板，W ppk2Pro化rward和 ppk2ProReverse為引物進行高保真PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離并回收，與 pCR-Blunt載體連接轉化大腸桿菌D冊曰，挑取數(shù)個陽性克隆進行DNA測序。JN459-M571中 ppk2啟動子的DNA序列如序列表中SEQ ID NO. 1所示，JN459中ppk2啟動子的DNA序列如 序列表中SEQ ID NO. 4所示。結果顯示，JN459-M571中ppk2基因啟動子有3個堿基的變 化，分別是-46位、-76位和-79位堿基由G變成A。
[0061] 將菌株JN459-M571于2015年12月1日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中屯、（簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生 物研究所），保藏編號為CGMCCNO. 11770。
[0062] 實施例6 :JN459-M571對污水中可溶性憐的去除效果驗證
[0063] 按下列成分配制人工合成污水：葡萄糖0.3g、蛋白腺0.Ig、酵母粉0.Olg、醋酸鋼 0. 15g、氯化錠0. 2g、氯化鋼0. 05g、憐酸氨二鐘0.Ig、硫酸儀0. 12g、純化水1L。實測NH/-N 為 65.Img/L，POa]-P為 14. 2mg/L。
[0064] 將JN459-M571菌株液體培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離屯、收集菌體，并用無菌水洗涂， 然后接種到10LSBR反應器中。采用好氧和缺氧循環(huán)工藝，每個循環(huán)過程中好氧時間為 12h，溶解氧濃度約為4mg/l，缺氧時間為12h，用無菌氮氣置換體系中空氣，維持溶解氧濃 度低于0. 2mg/L，整個工藝維持約3d，取樣檢測水相中可溶性憐含量，結果如圖1所示志 行后期檢測菌體中化ly-P含量，WJN459菌株為對照，結果如圖2所示。運行結果顯示， JN459-M571菌株在厭氧運行時可溶性憐上升幅度在7. 7% -10. 1%之間，顯著低于JN459菌 株（23. 9%-31. 3%之間）。同時JN459-M571菌株在72小時的可溶性憐去除率達到79. 8%， 顯著高于JN459菌株的59. 8%去除率；細胞內(nèi)化ly-P含量達到細胞干重的8. 6%，也高于 M59菌株的4. 3%。
【主權項】
1. 一種經(jīng)定向改造的ppk2基因啟動子，其特征在于，其具有如SEQIDNO. 1所示的核 苷酸序列，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個堿基形成的具有同等功能的核苷酸序 列。2. 權利要求1所述的啟動子在低氧條件下降低ppk2表達水平的應用。3. -種積磷小月菌，其含有權利要求1所述的經(jīng)定向改造的ppk2基因啟動子。4. 一株高效積累多聚磷酸鹽的積磷小月菌工程菌，該菌株為積磷小月菌 (Microlunatusphosphovorus)JN459_M571，已于2015年12月1日保藏于中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNO. 11770。5. -種菌劑，其特征在于，該菌劑的活性成分為權利要求4所述的積磷小月菌 JN459-M571。6. 權利要求4所述積磷小月菌JN459-M571和/或權利要求5所述菌劑在制備生物除 磷劑中的應用。7. 用于定向改造權利要求1所述ppk2基因啟動子的易錯PCR的引物，其特征在于，其 引物序列分別如SEQIDNO. 2和SEQIDNO. 3所示。8. 權利要求4所述的積磷小月菌JN459-M571的制備方法，其特征在于，采用連續(xù)易錯 PCR方法體外對ppk2基因的啟動子進行突變，以已有的積磷小月菌JN459為出發(fā)菌，通過同 源重組技術建立含有ppk2基因突變啟動子的菌株庫，測定好氧和厭氧運行條件下Poly-P 磷酸鹽含量的變化，篩選得到高性能積磷小月菌JN459-M571。9. 如權利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述連續(xù)易錯PCR方法體外突變ppk2 基因啟動子的方法為： (1)PCR反應體系：模板DNA2ul、PCR緩沖液 5ul、TaqDNA聚合酶lul、dATP1 ~3ul、 dTTP1 ~3ul、dGTP1 ~3ul、dCTP1 ~3ul、上游引物 2ul、下游引物 2ul、25mMMgCl2l~ 8ul、5mMMnCl20 ~lul，補加超純水至 50ul; (2) PCR條件：預變性95°C5分鐘，變性95°C30秒，退火52~60°C30秒，延伸72°C2 分鐘，循環(huán)30次，終延伸8分鐘； 第1次PCR的模板DNA來源于積磷小月菌JN459,第2次PCR及后續(xù)PCR的模板DNA采 用上次PCR產(chǎn)物； 所述上游引物和下游引物為權利要求7所述的易錯PCR的引物。10. 如權利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述含有ppk2基因突變啟動子的菌株 庫的構建方法為： (1) 構建攜帶ppk2基因上下游同源臂的穿梭載體pMV306K，將連續(xù)易錯PCR產(chǎn)物用瓊 脂糖凝膠電泳分離后回收PCR產(chǎn)物，與攜帶ppk2基因上下游同源臂的穿梭載體pMV306K在 GibsonCloningMasterMix作用下進行體外重組，轉化大腸桿菌DH5a，挑取轉化子提取質(zhì) 粒進行雙酶切鑒定； (2) 將重組pMV306K質(zhì)粒轉入JN459菌株，在同源重組作用下得到一系列轉化子，即構 建得到含ppk2基因啟動子突變體的菌株庫。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株高效積累多聚磷酸鹽的積磷小月菌工程菌，為積磷小月菌(Microlunatus？phosphovorus)JN459-M571，于2015年12月1日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC？NO.11770。本發(fā)明采用連續(xù)易錯PCR方法體外突變ppk2基因的啟動子，以JN459為出發(fā)菌，通過基因重組技術建立含有ppk2基因啟動子突變體的菌株庫，篩選獲得在厭氧條件下分解多聚磷酸鹽的能力下降，在好氧條件下合成多聚磷酸鹽的能力無顯著差異的JN459-M571菌株。本發(fā)明菌株在厭氧運行過程中比原始菌株JN459的Poly-P含量高2.4倍，可應用于污水處理廠的EBPR生物除磷工藝。CGMCC NO.1177020151201
【IPC分類】C12N1/21, C12N15/11, C12N15/113, C12R1/01, C02F3/34, C02F101/10
【公開號】CN105368838
【申請?zhí)枴緾N201510969862
【發(fā)明人】鐘傳青, 曹廣祥
【申請人】山東建筑大學, 山東省醫(yī)藥生物技術研究中心
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2015年12月21日