一種表達(dá)施馬倫貝格病毒重組n基因桿狀病毒的制備、鑒定方法以及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于一種桿狀病毒的制備、鑒定及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種 Vh〇"d-SBV-N桿狀病毒的制備、鑒定及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 施馬倫貝格病毒英文縮寫(xiě)：SBV，施馬倫貝格病毒病是一種新發(fā)的、流行于歐洲的 動(dòng)物傳染病。SBV可引起牛、山羊、綿羊、野牛等動(dòng)物發(fā)病，主要通過(guò)庫(kù)朦傳播，也可通過(guò)胎盤(pán) 垂直傳播。主要的臨床癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱、腹瀉、乏力、死胎、崎形胎、產(chǎn)奶量下降、新生幼畜先 天缺陷等臨床癥狀。SBV嚴(yán)重影響牲畜生產(chǎn)性能，危害畜牧業(yè)發(fā)展。歐洲是我國(guó)種畜引進(jìn)及 畜產(chǎn)品進(jìn)口的主要來(lái)源地區(qū)之一。鑒于SBV可能對(duì)我國(guó)畜牧業(yè)帶來(lái)的巨大經(jīng)濟(jì)損失，研究 該病毒的檢測(cè)方法具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明通過(guò)將SBVN基因重組于昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體基因中，并將其在昆蟲(chóng)細(xì) 胞中成功表達(dá)。表達(dá)蛋白的獲得為該病毒相應(yīng)檢測(cè)方法的研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。
[0004] 本發(fā)明中Vh^id-SBV-N桿狀病毒指的是表達(dá)施馬倫貝格病毒N蛋白的桿狀病毒。
[0005] 本發(fā)明采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。
[0006] 一種制備Vbacmid-SBV-N桿狀病毒方法，步驟如下：
[0007] 1)參照NCBI上公布的施馬倫貝格病毒：SBV的N基因開(kāi)放閱讀框序列設(shè)計(jì)了一對(duì) 含特異性酶切位點(diǎn)的引物，擴(kuò)增SBVN基因；
[0008] 2)將擴(kuò)增的SBVN基因克隆于昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體pFas巧acHTB;
[0009]如W步驟2得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞，得到重組穿梭質(zhì)粒 Bacmid-SBV-N；
[0010] 4)將步驟3得到的重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-SBV-N在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染S巧昆蟲(chóng)細(xì) 胞，得到Vbacmid-SBV-N的桿狀病毒。
[0011] 一種Vbacmid-SBV-N桿狀病毒的鑒定方法，步驟為，取Vbacmid-SBV-N桿狀病毒， 按1:1~1:10的比例感染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，27°C培養(yǎng)96h~12化后，取培養(yǎng)的病毒上清液， 通過(guò)SDS-PAGE方法進(jìn)行病毒鑒定：使用Bio-Radmini電泳儀，參照Bio-Radmini電泳儀 操作手冊(cè)說(shuō)明書(shū)，對(duì)培養(yǎng)的病毒上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，同時(shí)做兩塊凝膠，一塊用于染 色分析，另一塊用于Westernblot分析。SDS-PAGE電泳后，蛋白質(zhì)分子量在29. 6邸處出現(xiàn) 一條特征性的條帶。
[0012] 通過(guò)SDS-PAGE方法進(jìn)行病毒表達(dá)特征蛋白鑒定后，再通過(guò)Western blot方法對(duì) 病毒表達(dá)特征蛋白進(jìn)行鑒定：用Bio-Rad轉(zhuǎn)膜儀將SDS-PAGE凝膠電泳的各蛋白條帶轉(zhuǎn)移至 固相載體硝酸纖維素膜上，W抗SBV核蛋白的單克隆抗體1F2 (1:1000倍稀釋?zhuān)橐豢?，?抗鼠IgG-HRP(1:3000倍稀釋?zhuān)槎棺鯳estern blot分析，蛋白質(zhì)分子量在29. 6邸處出 現(xiàn)一條特征性的條帶。
[001引一對(duì)制備Vbacmid-SBV-N桿狀病毒使用的引物，SBVF: 5' -TTAGGATCCATGTCAAGCCAATTCA-3' ;SBVR:5' -ATTCTGCAGCGTTAGATGTTGATACCGA-3'。
[0014] 一對(duì)制備Vbacmid-SBV-N桿狀病毒使用的引物的酶切位點(diǎn)，SBVF的酶切位點(diǎn)為 GGATCC;SBVR的酶切位點(diǎn)為CTGCAG。
[0015] 一種Vbacmid-SBV-N桿狀病毒的應(yīng)用為，Vbacmid-SBV-N桿狀病毒穩(wěn)定表達(dá)SBV的 核蛋白：N蛋白。
[0016] 一種Vbacmid-SBV-N桿狀病毒的應(yīng)用為，Vbacmid-SBV-N桿狀病毒與抗SBVN蛋 白的單克隆抗體存在免疫學(xué)反應(yīng)。
[0017] 一種Vbacmid-SBV-N桿狀病毒的應(yīng)用為，利用Vbacmid-SBV-N桿狀病毒表達(dá)的SBV 核蛋白，作為SBV抗體檢測(cè)中酶聯(lián)免疫吸附試劑制備中的包被用抗原。
[0018] 一種Vbacmid-SBV-N桿狀病毒的應(yīng)用為，利用Vbacmid-SBV-N桿狀病毒表達(dá)的SBV 核蛋白，作為SBV抗體檢測(cè)中，膠體金試紙條制備中的金標(biāo)物質(zhì)。
[0019] 本發(fā)明的有益效果為，發(fā)明人基于昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)于原核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu) 點(diǎn)一-表達(dá)外源蛋白時(shí)具有完備的翻譯后加工修飾能力，開(kāi)展了SBV核蛋白在昆蟲(chóng)細(xì)胞上 的表達(dá)。在表達(dá)SBV蛋白的過(guò)程中，發(fā)明人為了控制轉(zhuǎn)染過(guò)程中試劑、操作等因素造成的誤 差，在轉(zhuǎn)染時(shí)，W實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的Bacmid-GFP作為陽(yáng)性對(duì)照，轉(zhuǎn)染后通過(guò)觀察綠色巧光 蛋白的表達(dá)證明轉(zhuǎn)染過(guò)程的可靠性，最終發(fā)明人通過(guò)蛋白電泳、免疫印跡的方法表明實(shí)驗(yàn) 獲得了具有生物活性的SBVN蛋白，準(zhǔn)確地鑒定了Vhemid-SBV-N桿狀病毒。
[0020] 下面就附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步解釋。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖 1 重組質(zhì)粒SBV-N的PCR擴(kuò)增圖（Fig. 1PCRamplificationofrecombinant plasmidSBV-腳
[0022] 其中：M.DM標(biāo)準(zhǔn)DL2000 ; 1-4.SBV-N引物SBVF/SBVR擴(kuò)增片段（M.DMMarker DL2000;l-4.PCRproductsofrecombinantplasmidSBV-NwithSBVF/SBVRprimers);
[0023] 圖 2 重組質(zhì)粒pMDlST-SBV-N的PCR擴(kuò)增圖（Fig. 2PCRamplificationof recombinantplasmidpMDlST-SBV-N)
[0024]其中：M.DM標(biāo)準(zhǔn)DL2000 ; 1-2.pMDlST-SBV-N引物SBVF/SBVR擴(kuò)增片段（M.DM MarkerDL2000 ; 1-2.PCRproductsofrecombinantplasmidpMD18T-SBV-NwithSBVF/ SBVRprimers)；
[00巧]圖 3 重組質(zhì)粒pFas1:BacHTB-SBV-N的酶切鑒定圖（Fig. 3Identificationofthe recombinantplasmidofpFastBacHTB-SBV-Nbyenzymedigestion)
[0026]其中：M.DM標(biāo)準(zhǔn)MarkerIV;1.pFas巧a地TB-SBV-N經(jīng)BamI和PstI雙酶切 (M.DNAMarkerIV; 1.Restrictionenzymeidentificationofrecombinantplasmid pFas巧a地TB-SBV-NbyBamI&PstI);
[0027]圖 4 重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-SBV-N的PCR擴(kuò)增圖（Fig. 4PCRamplificationof recombinantshuttleplasmidBacmid-SBV-N)
[0028]M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000 ; 1-5.Bacmid-SBV-N引物SBVF/SBVR擴(kuò)增片段
[002引（Μ.DNAMarkerDL2000;1-5.PCRproductsofrecombinantplasmid Bacmid-SBV-NwithSBVF/SBVRprimers)；
[0030] 圖 5 重組質(zhì)粒Bacmid-SBV-N的PCR鑒定圖（Fig. 5Identificationofthe recombinantplasmidBacmid-SBV-NbyPCR)
[0031]其中：M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL10000 ; 1-11.Bacmid-SBV-N用引物M13F和M13R的PCR產(chǎn)物； 12.Bacmid用引物M13F和M13R的PCR產(chǎn)物；（Μ.DNAMarkerDL1000 O; 1-11.PCRproducts ofrecombinantplasmidBacmid-SBV-NwithM13FandM13Rprimers； 12.PCRproducts ofcontrplplasmidBacmidwithM13FandM13Rprimers)；
[003引圖6重組蛋白在Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞上表達(dá)圖（10X16) (Fig. 6Expressionof recombinatproteininSf9cell)其中：（a).正常Sf9 細(xì)胞；（b).轉(zhuǎn)染Bacmid-PPRV-N 桿粒的Sf9 細(xì)胞；（c)轉(zhuǎn)染Bacmid-GFP24h的Sf9 細(xì)胞；（d)轉(zhuǎn)染Bacmid-GFP120h的Sf9 細(xì)胞；（a).normalSf9cells;(b).Sf9cellstransfectedwithBacmid-PPRV-N;(c). Sf9cellstransfectedwithBacmid-GFPfor24h； (d).Sf9cellstransfectedwith Bacmid-GFPfor120h;
[0033] 圖 7 重組蛋白的表達(dá)鑒定圖（Fig. 7Identificationofrecombinantprotein)
[0034]其中：M.蛋白預(yù)染Marker;1.Vbacmid-SBV-N(原液）；2.V油cmid-SBV-N(原液）； 3.純化的His-SBV-N蛋白（3倍稀釋?zhuān)?.純化的MBP-SBV-N蛋白（3倍稀釋?zhuān)?br>[0035]Μ.Marker; 1.Vbacmid-SBV-Nprotein;2.V油cmid-SBV-Nprotein;3.Purified His-SBV-Nprotein(3timesdilution) ；4.PurifiedMBP-SBV-Nprotein(3times dilution)
[0036] (a).SDS-PAGE;化）.Western-blot。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 一種制備Vbacmid-SBV-N桿狀病毒方法，步驟如下：
[003引1)參照NCBI上公布的施馬倫貝格病毒：SBV的N基因開(kāi)放閱讀框序列設(shè)計(jì)了一對(duì) 含特異性酶切位點(diǎn)的引物，擴(kuò)增SBVN基因；
[0039] 2)將擴(kuò)增的SBVN基因克隆于昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體pFas巧a地TB;
[0040] 3)W步驟2得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畑lOBac感受態(tài)細(xì)胞，得到重組穿梭質(zhì)粒 Bacmid-SBV-N；
[00川 4)將步驟3得到的重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-SBV-N在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染S巧昆蟲(chóng)細(xì) 胞，得到Vbacmid-SBV-N的桿狀病毒。
[0042] 一種Vbacmid-SBV-N桿狀病毒的鑒定方法，步驟為，取Vbacmid-SBV-N桿狀病毒， 按1:1~1:10的比例感染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，27°C培養(yǎng)96h~12化后，取培養(yǎng)的病毒上清液， 通過(guò)SDS-PAGE方法進(jìn)行病毒鑒定：使用Bio-Radmini電泳儀，參照Bio-Radmini電泳儀 操作手冊(cè)說(shuō)明書(shū)，對(duì)培養(yǎng)的病毒上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，同時(shí)做兩塊凝膠，一塊用于染 色分析，另一塊用于Westernblot分析。SDS-PAGE電泳后，蛋白質(zhì)分子量在29. 6邸處出現(xiàn) 一條特征性的條帶。
[0043] 通過(guò)SDS-PAGE方法進(jìn)行病毒表達(dá)特征蛋白鑒定后，再通過(guò)Westernblot方法對(duì) 病毒表達(dá)特征蛋白進(jìn)行鑒定：用Bio-Rad轉(zhuǎn)膜儀將SDS-PAGE凝膠電泳的各蛋白條帶轉(zhuǎn)移至 固相載體硝酸纖維素膜上，W抗SBV核蛋白的單克隆抗體1F2 (1:1000倍稀釋?zhuān)橐豢?，?抗鼠IgG-HRP(1:3000倍稀釋?zhuān)槎棺鯳esternblot分析，蛋白質(zhì)分子量在29. 6邸處出 現(xiàn)一條特征性的條帶。
[0044] -對(duì)制備Vbacmid-SBV-N桿狀病毒使用的引物，SBVF:5'-TTAGGATCCATGTCAAGCC AATTCA-3' ;SBVR:5' -ATTCTGCAGCGTTAGATGTTGATACCGA-3'。
[004引一對(duì)制備Vbacmid-SBV-N桿狀病毒使用的引物的酶切位點(diǎn)，SBVF的酶切位點(diǎn)為GGATCC;SBVR的酶切位點(diǎn)為CTGCAG。
[0046] -種Vbacmid-SBV-N桿狀病毒的應(yīng)用為，Vbacmid-SBV-N桿狀病毒穩(wěn)定表達(dá)SBV的 核蛋白：N蛋白。
[0047] -種Vbacmid-SBV-N桿狀病毒的應(yīng)用為，Vbacmid-SBV-N桿狀病毒與抗SBVN蛋 白的單克隆抗體存在免疫學(xué)反應(yīng)。
[0048] 一種Vbacmid-SBV-N桿狀病毒的應(yīng)用為，利用Vbacmid-SBV-N桿狀病毒表達(dá)的SBV 核蛋白，作為SBV抗體檢測(cè)中酶聯(lián)免疫吸附試劑制備中的包被用抗原。
[0049] -種Vbacmid-SBV-N桿狀病毒的應(yīng)用為，利用Vbacmid-SBV-N桿狀病毒表達(dá)的SBV 核蛋白，作為SBV抗體檢測(cè)中，膠體金試紙條制備中的金標(biāo)物質(zhì)。
[0050] 實(shí)施例：
[0051] 1材料與方法
[0052