XAnnealingBufferl0μレ無(wú)核酸酶水30μL;反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C3min,W rC/min的速度降溫,直至降到25°C,25°C保溫30min后于4°C保存。
[0043] 可選的,步驟(C)中所述的連接反應(yīng)的體系為:酶切產(chǎn)物20μ^5Χ0ΝΑLigase ReactionBuffer8μL,DM連接酶2μL,無(wú)核酸酶水5μL,接頭混合物5μL;混勻后置于 PCR上,反應(yīng)程序?yàn)椋?2°C保溫lh,65°C保溫30min,降溫至4°C保存。
[0044] 可選的,步驟(4)中進(jìn)行測(cè)序使用的測(cè)序試劑盒為化xtSeq500化曲Ou化ut Kit(75cycles)。
[0045] 可選的,步驟(5)中進(jìn)行測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)基因組的軟件為bowtie2(版本號(hào) bowtie2-2. 2. 3)(基于Linux操作系統(tǒng)),SNP鑒定軟件為^ssel(版本號(hào)tassel-4. 3. 13)。 在本發(fā)明中,SNP標(biāo)記位點(diǎn)可W通過(guò)W下方式進(jìn)行挖掘:分析腳本如下,^限制性內(nèi)切酶組 合EcoRI-MseI為例。
[0046] ①tassel-4. 3. 13/run_pipeline.pl-Xmx32g-forkl
[0047] -FastqToT'agCountPlugin-ifq/-s300000000-k
[0048] keyfile_eco_mse.txt_eEcoRI-Msel-c3-0tagCounts
[0049] -endPlugin-runforkl
[0050] ③tassel-4. 3. 13/run_pipeline.pl-Xmx32g-forkl
[0051] -MergeMultiplel'agCountPlugin-itagCounts-o
[0052] mergedTagCounts/myMasterGBSTags.cnt-endPlugin-runforkl
[0053] tassel-4. 3. 13/run_pipeline.pl-Xmx32g-forkl
[0054] -^gCountToFastciPlugin
[0055] -i. /mergedTagCounts/myMasterGBSTags.cnt
[0056] -〇. /mergedTagCounts/myMasterGBSTags.fq-endPlugin
[0057] -runforkl
[0058] bowtie2_2· 2. 3/bowtie2-p16-ve:ry-sensitive-local
[0059] -X. . /. . /ref/cow.big_chr-UmyMasterGBSTags.fq-S
[0060] myAlignedMasterl'ags.sam
[0061] ③tassel-4. 3. 13/run_pipeline.pl-Xmx32g-forkl [006引-SAMConve:rterPlugin-i
[0063] mergedTagCou打ts/myAlig打edMasterTags.sam-o
[0064] topm/myM過(guò)sterT過(guò)gs.topm-endPlugin-runforkl
[0065] ④tassel-4. 3. 13/run_pipeline.pl-Xmx32g-forkl
[0066] -FastqToTBTPlugin-ifq/-kkeyfile_eco_mse.txt~e
[0067] EcoRI-Msel-c3-0 化t-y
[0068] -t. /mergedTagCounts/myMasterGBSTags.cnt-endPlugin
[0069] -runforkl
[0070] tassel-4. 3. 13/run_pipeline.pl-Xmx32g-forkl
[0071] -Mergel'agsByl'axaFilesPlugin-i化t-〇
[0072] mergedTBT/myS化dy.tbt.byte-endPlugin-runforkl
[0073] ⑥tassel-4. 3. 13/run_pipeline.pl-Xmx64g-forkl
[0074] -Discove:rySNPCallerPlugin-i· /mergedTBT/myStudy.化t.byte-y
[0075] -m. /topm/myMasterTags.topm
[0076] _mUpd. /topm/myMasterTagsWithVaria打ts.topm-vcf
[00"77] -〇· /hapmap/raw/myGBSGenos_chr+.hmp.txt-mnMAF0· 05
[0078] -ref. ·/ref/gga4.big_chr.fa_sCl_eC3〇-endPlugin_runforkl
[0079] ?tassel-4. 3. 13/run_pipeline.pl-Xmx32g-forkl
[0080] -MergeDuplicateSNPsPlugin-hmp
[0081] hapmap/raw/myGBSGenos_cb+.hmp.txt-〇
[0082] hapmap/mergedSNPs/myGBSGenos_mergedSNPs_chr+.hmp.txt
[0083] -misMat0.l_sCl_eCSO-endPlugin-runforkl
[0084] ⑦tassel-4. 3. 13/;run_pipeline.pl-Xmx32g-forkl
[0085] -GBSHapMapFi11ersP1ugin-hmp
[0086] hapmap/mergedSNPs/myGBSGenos_mergedSNPs_chr+.hmp.txt
[0087] -〇hapmap/filt/myGBSGenos_mergedSNPsFilt_chr+.hmp.txt
[0088] -mnTCov0. 01-mnSCov0. 6-mnMAF0. 05-sC1-eC30
[0089] -endPlugin-runforkl
[0090] 本發(fā)明還提供了所述方法在基因分型研究中的應(yīng)用。
[0091] 可選的,所述應(yīng)用包括對(duì)豬、牛、羊、雞進(jìn)行基因分型。
[0092] 本發(fā)明所提供的方法在PCR前通過(guò)上述磁珠純化的方式進(jìn)行片段選擇,使得過(guò)大 或者過(guò)小的片段都在PCR前被去除,從而提高測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量。
[0093] 本發(fā)明所提供的方法包括根據(jù)不同酶切組合所獲得的SNP標(biāo)記位點(diǎn)個(gè)數(shù)、酶切片 段大小確定針對(duì)目的基因組的特定酶切組合。優(yōu)選的酶切組合標(biāo)準(zhǔn)包括:適中的酶切密度, SNP在基因組分布均勻,SNP密度適中,酶切不受到DNA修飾的影響等本領(lǐng)域技術(shù)人員所公 知的酶切組合選擇標(biāo)準(zhǔn)。
[0094] 本發(fā)明所開發(fā)的方法,通過(guò)生物信息學(xué)電子預(yù)測(cè)和酶切選擇實(shí)驗(yàn)可W篩選出任意 物種進(jìn)行測(cè)序分型的最有效酶切實(shí)驗(yàn)方案,可W在保證準(zhǔn)確度的前提下,使現(xiàn)有的分型成 本降低一個(gè)數(shù)量級(jí),具有較大應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0095] 圖1為基因組單酶切及雙酶切的電泳膠圖,泳道1為化bpMarker,泳道2為10化P Marker,泳道3為PstI酶切產(chǎn)物,泳道4為BglII酶切產(chǎn)物,泳道5為化nPII酶切產(chǎn)物, 泳道6為PstI-HF酶切產(chǎn)物,泳道7為EcoRI+MseI酶切產(chǎn)物,泳道8為ApeKI酶切產(chǎn) 物,泳道9為EcoRI酶切產(chǎn)物,泳道10為MspI酶切產(chǎn)物,泳道11為l(K)bpMaker,泳道12 為化bpMaker,泳道13為BglII+ApeKI酶切產(chǎn)物,泳道14為PstI+ApeKI酶切產(chǎn)物,泳 道15為化nPlI+ApeKI酶切產(chǎn)物,泳道16為MseI酶切產(chǎn)物,泳道17為PstI+MspI酶 切產(chǎn)物,泳道18為EcoRI+MspI酶切產(chǎn)物,泳道19為PstI+MseI酶切產(chǎn)物,泳道20為 HinPlI+MseI酶切產(chǎn)物。
[0096] 圖2為測(cè)序質(zhì)量報(bào)告圖。
【具體實(shí)施方式】
[0097] 下面將通過(guò)【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0098] 實(shí)施例1
[0099] 實(shí)施例1利用牛基因組說(shuō)明本發(fā)明所提供的分析方法。
[0100] 1、酶切片段數(shù)預(yù)測(cè)
[0101] 編寫perl腳本Site_predict.pi如下,需要輸入的文件為?;蚪M的染色體名 稱、序列W及被預(yù)測(cè)酶的酶切位點(diǎn)序列。運(yùn)行命令為:perlSite_predict.pl。牛的基因組 序列從化sembl上下載,版本號(hào)為:
[0102] UMD3.1,INSDC Assembly GCA_000003055.3