一種用于鑒定分枝桿菌菌種的試劑盒及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種用于鑒定分枝桿菌菌種的試劑盒及方法，屬于分子生物學技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)技術(shù)自從1985年問世W來，經(jīng)過幾十年的發(fā)展，已成為實驗 室的常規(guī)技術(shù)。它是現(xiàn)代分子生物學研究中不可缺少的手段，是一種極為敏感的放大系統(tǒng)。 相比于傳統(tǒng)的臨床診斷方法，核酸診斷是分子水平上的診斷技術(shù)，可W彌補傳統(tǒng)臨床診斷 方法的某些缺陷。因此，WPCR技術(shù)為代表的核酸診斷技術(shù)在臨床診斷中得到日益廣泛的 應(yīng)用。
[000引與傳統(tǒng)的PCR檢測模式相比，近年來將傳統(tǒng)PCR檢測模式中的PCR擴增和檢測相 結(jié)合（即在同一個密閉容器中將PCR擴增反應(yīng)與巧光標記探針檢測結(jié)合在一起）檢測目的 核酸的巧光PCR檢驗方法紛紛出臺。巧光PCR檢驗方法不僅具有普通PCR的高靈敏性，而 且由于應(yīng)用了巧光探針，所W還具有DNA雜交的高特異性和光譜技術(shù)的高精確性，克服了 常規(guī)PCR的許多缺點，不需要PCR后處理，避免了常規(guī)PCR操作中的諸多弊端，從而可W快 速W及動態(tài)地檢測PCR擴增產(chǎn)物并減少外來核酸造成的污染。
[0004] 巧光PCR檢測試劑最早使用的巧光染料包括：SYBRGREEN,EVEGREEN,染料方法盡 管簡單，但無法識別非特異擴增，因此在實際應(yīng)用中受到很大的限制。如今多W采用巧光探 針為基礎(chǔ)方法，例如化qman探針、分子信標和巧光雜交探針等，巧光探針實時監(jiān)控PCR擴增 產(chǎn)物的特異性，從而避免了非特異性擴增，提高了祀序列的特異性。不過如上所述的探針普 遍存在對單堿基突變或多堿基插入或缺失識別能力有限的缺點。
[0005] 巧光PCR在臨床上的應(yīng)用主要分為：感染性疾病的診斷；遺傳疾病的診斷；腫瘤的 診斷；母嬰傳播的診斷和法醫(yī)學鑒定等。
[0006] 臨床可見能引起人類疾病的主要是結(jié)核分枝桿菌（MTB)，此外還有堪薩斯、鳥、 胞內(nèi)、猿猴、贍餘、海、潰瘍、療痛、馬爾摩、蘇加、偶然、龜、脈腫等10余種非結(jié)核分枝桿菌 (NTM)。NTM病具有與結(jié)核病臨床表現(xiàn)相似的全身中毒癥狀和局部損害，在無菌種鑒定結(jié)果 的情況下，與結(jié)核病難W鑒別。NTM與MTB藥物敏感性大不相同，許多NTM對抗結(jié)核藥物天 然耐藥，不同NTM菌種對藥物敏感性亦不相同，化療方案應(yīng)根據(jù)不同菌種有所不同，因此， 分枝桿菌菌種鑒定不僅在流行病學上，而且在臨床診斷和治療上均有重要意義。
[0007] 而目前傳統(tǒng)的分枝桿菌菌種鑒定方法依據(jù)生物學表型特征及細胞化學反應(yīng)多項 指標綜合分析，方法復雜、費時，急需建立快速、簡便、準確的分枝桿菌菌種鑒定方法。近年 來，隨著分子生物學理論及技術(shù)，特別是W聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)為基礎(chǔ)的各種分子診斷技 術(shù)的快速發(fā)展，分子診斷技術(shù)已在分枝桿菌菌種鑒定中得W研究應(yīng)用。
[0008] 目前已有一些WPCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分枝桿菌菌種鑒定的方法，如PCR-直接測序 法、PCR-RFLP、PCR-基因忍片法等，運些方法普遍存在操作復雜，易造成交叉污染等缺點。
[0009] 本發(fā)明人在2012年8月15日公開的名稱為"一種新的分枝桿菌菌種快速鑒定方 法及試劑盒"的中國發(fā)明專利CN102634575B中公開了一種用于鑒定分枝桿菌菌種的試劑 盒，其中包括兩對引物和Ξ條探針，所述兩對引物包括引物TBleftl、TBleft2、TBri曲tl和 了8'1曲12，其核巧酸序列分別如沈9 10^:1、569 10^:2、569 10^:3、569 10^:4所 示，所述Ξ條探針TBProbel、TBProbe2、TBProbe3的5'端用報告巧光染料標記，3'端用澤 滅巧光染料標記，其核巧酸序列分別如SEQIDN0:13、SEQIDN0:14、SEQIDN0:15所示。 經(jīng)過實驗，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，此專利文獻所公開的方法中由于只使用了普通雙標記探針，部分菌 種間Tm值差異較小，僅適用于分離培養(yǎng)的單一菌種鑒定，而對兩種或多種菌同時存在的情 況，則無法鑒別。
[0010] 因此，提供一種能夠準確有效的鑒定兩種或多種分枝桿菌菌種的試劑盒和方法就 成為該技術(shù)領(lǐng)域急需解決的技術(shù)難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的之一是提供一種能夠準確有效的鑒定兩種或多種分枝桿菌菌種的 試劑盒。
[0012] 本發(fā)明的上述發(fā)明目的是通過W下技術(shù)方案達到的：
[0013] 一種用于鑒定分枝桿菌菌種的試劑盒，其中鑒別試劑包括Ξ對引物和五條探針， 所述引物包括上游引物primerl、下游引物primers、上游引物primers、下游引物primerA、 上游引物primer5和下游引物primerG;引物primer1、primer2、primer3、primerA、primer5 和primer6 的核巧酸序列分別如沈QIDNO. 6、SEQIDNO. 7、SEQIDNO. 8、SEQIDNO. 9、 SEQIDNO. 10、SEQIDNO. 11所示；所述探針包括3個區(qū)域：與所述祀核酸序列互補的5' 端單鏈祀核酸序列結(jié)合部位作為第1區(qū)域；與所述祀核酸序列互補的3'端單鏈祀核酸序列 結(jié)合部位作為第2區(qū)域；與所述5'端和所述3'端結(jié)合部位相連接的非結(jié)合突起部位作為 第3區(qū)域；所述五條探針分別為P;robel、P;robe2、P;robe3、P;robe4和ProbeS;其核巧酸序列 分別如沈QIDNO. 1、SEQIDNO. 2、SEQIDNO. 3、SEQIDNO. 4、SEQIDNO. 5 所示。
[0014] 優(yōu)選的，所述探針為帶有核酸修飾的雙標記和雙特異性探針，核酸修飾為鎖核酸 修飾，修飾所述探針第1區(qū)域內(nèi)與祀核酸序列存在突變差異的核酸位點。
[0015] 優(yōu)選的，所述探針還包括一個巧光基團和一個非巧光巧滅基團，巧光基團標記在 所述探針的所述第1區(qū)域5'末端或所述第2區(qū)域3'末端，非巧光巧滅基團標記在探針的 第1區(qū)域內(nèi)部的核巧酸殘基上。
[0016] 優(yōu)選的，所述巧光基團選自肥X和/或R0X。
[0017] 優(yōu)選的，所述非巧光巧滅基團選自B冊1和/或8冊2。
[0018] 優(yōu)選的，所述的分枝桿菌選自結(jié)核分枝桿菌（M.化berculosis)、堪薩斯分枝桿 菌（M.kansasii)、療痛分枝桿菌（M.scrofulaceum)、海分枝桿菌（M.marmum)、潰瘍分枝 桿菌（M.ulcerans)、胞內(nèi)分枝桿菌（M.intracellulare)、鳥分枝桿菌（M.avium)、恥垢分 枝桿菌（M.smegmatis)、偶然分枝桿菌（M.fortuitum)、龜分枝桿菌龜亞種（M.chelonae subsp.chelonae)、龜分枝桿菌脈腫亞種（Μ.chelonaesubsp.油scessus)、贍餘分枝桿菌 (Μ.xenopi)中的一種或二種W上的組合。
[0019] 其中探針Probel可W有效鑒別結(jié)核分枝桿菌、海分枝桿菌/潰瘍分枝桿菌、胞內(nèi) 分枝桿菌/鳥分枝桿菌/偶然分枝桿菌、療痛分枝桿菌/堪薩斯分枝桿菌、恥垢分枝桿菌/ 龜分枝桿菌/脈腫分枝桿菌/贍餘分枝桿菌；探針Probe2可W有效鑒別胞內(nèi)分枝桿菌、鳥 分枝桿菌/贍餘分枝桿菌、偶然分枝桿菌/恥垢分枝桿菌、龜分枝桿菌/脈腫分枝桿菌；探 針Probe3可W有效鑒別海分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌；探針Probe4可有效鑒別龜分枝桿菌、 脈腫分枝桿菌；探針Probes可有效鑒別療痛分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌。
[0020] 本發(fā)明的另一目的是提供一種上述試劑盒在制備用于鑒定分枝桿菌的產(chǎn)品中的 應(yīng)用。
[0021] 本發(fā)明的上述發(fā)明目的是通過W下技術(shù)方案達到的：
[0022] 上述用于鑒定分枝桿菌菌種的試劑盒在制備用于鑒定分枝桿菌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0023]本發(fā)明的再一目的是提供一種能夠準確有效的鑒定兩種或多種分枝桿菌菌種的 方法。
[0024] 本發(fā)明的上述發(fā)明目的是通過W下技術(shù)方案達到的：
[00巧]一種用于鑒定分枝桿菌菌種的方法，其步驟如下：
[0026] (1)引物和探針的設(shè)計合成
[0027] 設(shè)計五條帶有核酸修飾的雙標記和雙特異性探針，所述探針的寡核巧酸序列表如 下表1 :
[0028]表1
[0029]
[0030] 其中，所述FAM:-種巧光基團，激發(fā)光波長495皿，發(fā)射光波長521皿;B冊IdT:標 記了澤滅基團B冊1的胸腺喀晚脫氧核糖核巧酸；P04 :表示憐酸化修飾；肥X:-種巧光基 團，激發(fā)光波長535nm，發(fā)射光波長556nm巧冊2dT:標記了澤滅基團B冊2的胸腺喀晚脫氧 核糖核巧酸；R0X:為一種巧光基團，激發(fā)光波長575nm，發(fā)射光波長602nm "表示該位置 為鎖核酸（LNA)修飾的非自然核巧酸；W"http://"表示為中間標記；"_"表示為非結(jié)合突 起部位的核巧酸；
[0031] 引物設(shè)計：探針包括3個區(qū)域：與祀核酸序列互補的5'端單鏈祀核酸序列結(jié)合部 位作為第1區(qū)域；與祀核酸序列互補的3'端單鏈祀核酸序列結(jié)合部位作為第2區(qū)域；與5' 端和3'端結(jié)合部位相連接的非結(jié)合突起部位作為第3區(qū)域；
[0032] 第1區(qū)域設(shè)計上游引物primerl和下游引物primed;第2區(qū)域設(shè)計上游引物 primers和下游引物primerA;第3區(qū)域設(shè)計上游引物prime巧和下游引物primerG，所述 引物的核巧酸序列表如下表2所示；
[0033]表2
[0034]
[00對第1區(qū)域探針prob