一種沙雷菌定量檢測熒光pcr試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及醫(yī)學檢驗技術領域，具體設及一種沙雷菌定量檢測巧光PCR試劑盒及 其應用。
【背景技術】
[0002] 沙雷菌是一種能引起沙雷菌肺炎和敗血癥的致病菌，在環(huán)境中廣泛存在，主要為 醫(yī)院內獲得性感染，發(fā)病率明顯增多，且耐藥菌株增多，治療困難。與一般急性細菌性肺炎 相似，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、寒戰(zhàn)、咳嗽、咯血?；蚣傩匝；螯S疲、呼吸困難、胸痛。沙雷菌感染 已成為常見的、傳播廣泛的條件致病菌之一，但早期診斷困難，常常導致治療時機延誤，病 死率高。傳統(tǒng)的分離、培養(yǎng)和病理鑒定等診斷方法敏感性低、陽性率低。早期、快速、簡便、 敏感、特異的診斷方法是目前條件性沙雷菌感染實驗診斷研究領域的熱點。
[000引巧光PCR技術在1995年由美國陽公司率先研制成功，它兼有PCR的高靈敏性、DNA雜交的特異性和光譜技術精確定量的優(yōu)點，結果直觀，能直接檢測PCR過程中的變化。與普 通PCR相比，其結果可實時觀察，產(chǎn)物不需要凝膠電泳檢測，完全閉管操作，有效地降低了 污染。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明需要解決的現(xiàn)有技術的問題是：沙雷菌感染早期診斷困難，現(xiàn)有技術的診 斷方法敏感性低、陽性率低，導致病情延誤。
[0005] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種沙雷菌定量檢測巧光PCR試劑盒，用來解 決現(xiàn)有的沙雷菌感染診斷困難，敏感性低、陽性率低的問題。
[0006] 具體而言，本發(fā)明提供了一種沙雷菌定量檢測巧光PCR試劑盒，所述的試劑盒包 括陽性標準品、陰性標準品、反應液和DNA聚合酶，所述陽性標準品、陰性標準品和反應液 中均含有用于沙雷菌檢測的特異性引物和特異性探針。
[0007] 優(yōu)選的，所述特異性引物包括引物1和引物2,其中引物1的序列SQ1為： 5' -cacgccatcagatgtgcc-3';
[0008] 引物 2 的序列SQ2 為：5, -agtgtggctggtcatcctctc-3,。
[0009] 優(yōu)選的，所述特異性探針為帶有巧光基團和澤滅基團的特異性序列，其中，所述的 巧光基團選自FAM、肥X、TET、VIC中的一種，優(yōu)選為FAM、VIC;所述的澤滅基團選自MGB、 TAMRA、B冊中的一種，優(yōu)選為MGB。
[0010] 優(yōu)選的，所述的特異性探針的序列SQ3為：5' -ctcacctaggcgacgat-3'。
[0011] 優(yōu)選的，所述陽性標準品中含有插入了沙雷菌特異性DNA序列SQ4的重組質粒，其 中，SQ4的序列如下：
[0012] cttcgggcctcacgccatcagatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaatgg 60
[0013] ctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgag 120
[0014] 曰c曰cggtcc曰 g曰ctcct曰eggg曰ggc曰gc曰 gtgggg曰曰t曰 ttgc曰c曰曰tgggege曰曰gee 180
[0015] 優(yōu)選的，所述重組質粒的濃度為1.OX1〇3~1. 0X107。
[0016] 優(yōu)選的，所述的陰性標準品包含有不含沙雷菌特異性DNA序列的質粒。
[0017] 優(yōu)選的，所述的質?；蛑亟M質粒相同，選自祀了3、口11〔3、口61-1\地1?322、口10-1'中的 一種，優(yōu)選為pGM-T、地R322。
[0018] 優(yōu)選的，所述的反應液還包括緩沖液和dNTPs。
[0019] 優(yōu)選的，所述的緩沖液包括Ξ徑甲基氨基甲燒、氯化鐘和氯化儀。
[0020] 優(yōu)選的，所述的Ξ徑甲基氨基甲燒的濃度為50~200禮，優(yōu)選為100~150mM;氯 化鐘的濃度為300~800mM，優(yōu)選為400~600mM;氯化儀的濃度為10~30mM，優(yōu)選為10~ 20mM〇
[0021] 優(yōu)選的，所述的DNA聚合酶為化qDNA聚合酶。
[0022] 本發(fā)明同時提供了引物1的序列SQ1、引物2的序列SQ2和特異性探針的序列SQ3 用于制備沙雷菌含量測定用試劑中的應用。
[0023] 優(yōu)選的，所述的沙雷菌含量測定用試劑的使用方法如下：
[0024] 取樣本DNA加入到反應液中，作為樣品檢測組，然后分別在陽性標準品、陰性標準 品W及樣品檢測組中加入DNA聚合酶，混合均勻后進行巧光定量PCR反應，其中反應液、陽 性標準品、陰性標準品中均含有引物1的序列SQ1、引物2的序列SQ2和特異性探針的序列 SQ3。
[00巧]優(yōu)選的，所述的巧光定量PCR反應條件為：94~95°C預變性2~5min，1個循環(huán)； 94~95°(：15~203、55~601：30~503,40~50個循環(huán)。
[0026] 其中，所述的質粒可W為本領域常用的任何可插入外源基因的質粒，可W為常見 的祀Ts系列、pUCs系列、PBR322、pGM-T等，pUCs系列優(yōu)選為PUC18、PUC19等。
[0027] 其中，特異性引物與特異性探針根據(jù)沙雷菌高度保守序列特性設計，用于檢測沙 雷菌。
[0028] 而且，發(fā)明人創(chuàng)造性的選取了沙雷菌特異性DNA序列SQ4,將其與質粒載體連接的 重組質粒作為陽性標準品，其檢測的特異性高，靈敏度高。
[0029] 本發(fā)明的有益效果為：
[0030] 1)本發(fā)明試劑盒定量準確，兼有PCR的高靈敏性、DNA雜交的特異性和光譜技術精 確定量的優(yōu)點，結果直觀，能直接檢測PCR過程中的變化，與普通PCR相比，其結果可實時觀 察，產(chǎn)物不需要凝膠電泳檢測，完全閉管操作，有效地降低了污染。
[0031] 2)本發(fā)明試劑盒檢測靈敏度和特異性高，由于采取特異性引物和探針的雙保險設 計，靈敏度和特異性均有很大提高，能在臨床癥狀出現(xiàn)之前檢測到沙雷菌的感染。
[0032] 3)本發(fā)明試劑盒檢測速度快，總共僅需2個小時，步驟簡單，可同時進行高通量樣 本檢測。
[0033] 下面結合附圖和各個【具體實施方式】，對本發(fā)明及其有益技術效果進行詳細說明， 其中：
【附圖說明】
[0034]圖1為實施例一的沙雷菌陽性標準品的巧光PCR擴增曲線和陰性標準品的巧光 PCR擴增曲線。
[003引圖2為實施例一的沙雷菌臨床樣本的巧光PCR擴增曲線。
【具體實施方式】
[0036] 如上所述，本發(fā)明提供了一種用于沙雷菌定量檢測巧光PCR試劑盒，其目的是為 了提高被測人群沙雷菌診斷的靈敏度和特異性，提供早期診斷的可靠性。
[0037] 具體而言，本發(fā)明提供了一種沙雷菌定量檢測巧光PCR試劑盒，所述的試劑盒包 括陽性標準品、陰性標準品、反應液和DNA聚合酶，所述陽性標準品、陰性標準品和反應液 中均含有用于沙雷菌檢測的特異性引物和特異性探針。
[0038] 其中，在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式中，所用到的特異性引物W及特異性探針的 DNA序列分別為：
[0039]特異性引物1的序列SQ1為：5' -cacgccatcagatgtgcc-3'，作為正向引物；
[0040]特異性引物2的序列SQ2為：5' -agtgtggctggtcatcctctc-3'，作為反向引物；
[0041]特異性探針的序列SQ3 為：5' -ctcacctaggcgacgat-3'。
[0042] 在所述陽性標準品中含有插入沙雷菌特異DNA序列SQ4的pGM-T載體質粒，所插 入序列SQ4如下：
[0043]SQ4:
[0044]cttcgggcctcacgccatcagatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaatgg 60
[0045]ctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgag 120
[0046] 過c過cggtcc過 g過ctcct過eggg過ggc過gc過 gtgggg過過t過 ttgc過c過過tgggcgc過過gcc 180
[0047] 在本發(fā)明的具體實施中，所述陽性工作標準品含有重組質粒的濃度為1. OX lO3~ 1.OXl〇7。
[0048] 本發(fā)明中的樣本DNA不僅僅來源于動物或人體的全血液或者肺泡灌洗液，還可W 是任何與沙雷菌相關的樣本。本發(fā)明提到的特異性引物1的序列SQ1和引物2的序列SQ2 W及特異性探針的序列SQ3可W應用于制備測量沙雷菌含量的試劑。
[0049] 應當說明的是，實施例中未說明的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領域實驗人員 常規(guī)的方法，具體可參照薩姆布魯克和拉塞爾主編的《分子克隆實驗指南》第Ξ版，或按照 制造廠商所建議的步驟和條件。
[0050] 下面結合附圖和具體的實施例對本發(fā)明做進一步詳細的說明，其中實施例中所用 的試劑和儀器的廠家如下：
[0051] 巧光定量PCR儀，廠家：美國ABI實時巧光定量PCR儀7500,美國；
[0052]dNTPs，廠家：TAKARA，日本；
[0053]TaqDNA聚合酶，廠家：TAKARA，日本；
[0054]DNA基因組提取試劑盒，購自天根公司；
[00巧]pGM-T質粒載體，PUC18質粒載體，PMD18-T質粒載體，均購自天根生化科技（北 京）有限公司；
[0056] 本發(fā)明中用到的特異性引物，W及特異性探針序列均由上海英驗生物技術有限公 司合成，其中，特異性探針上連接的巧光基團和澤滅基團一并由上海英俊生物技術有限公 司合成。
[0057] 實施例一
[005引（一）試劑盒的準備
[0059] (1)引物和探針設計與合成
[0060] 根據(jù)沙雷菌的高度保守序列，設計了特異性引物和特異性探針，
[0061] 其中，正向引物SQ1 為 5, -cacgccatcagatgtgcc-3，；
[0062] 反向引物SQ2 為 5, -agtgtggctggtcatcctctc-3，；
[0063]特異性探針SQ3為5' -ctcacctaggcgacgat-3'，其中MGB作為澤滅基團，F(xiàn)AM作為 巧光基團，F(xiàn)AM和MGB分別連接在特異性探針序列SQ3的5'和3'端。
[0064] (2)沙雷菌陽性模板的制備
[0065] 制備含有沙雷菌核酸序列的質粒作為陽性模板，用于在試劑盒檢測時制備陽性標 準品。
[0066] 首先使用引物SQ5 :5, -cttcgggcctcacgc-3,和引物SQ6 :5, -ggcttgcgcccattg-3'，采用常規(guī)PCR技術擴增沙雷菌基因祀序列，然后將經(jīng)過純化的PCR產(chǎn)物連接到pGM-T載 體上，得到連接有目的基因的質粒；接著轉化大腸桿菌T0P10感受態(tài)細胞，并通過篩選構建 好的重組質粒作為陽性標準品，將構建的重組質粒經(jīng)雙向DNA