顱內(nèi)動(dòng)脈瘤標(biāo)志物odam及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及腫瘤標(biāo)志物，具體設(shè)及煩內(nèi)動(dòng)脈瘤標(biāo)志物0DAM及其應(yīng)用，更具體的設(shè) 及標(biāo)志物0DAM基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備煩內(nèi)動(dòng)脈瘤診療制劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 煩內(nèi)動(dòng)脈瘤（intracranialaneu巧sm，IA)是指多種因素造成的煩內(nèi)動(dòng)脈壁結(jié) 構(gòu)破壞，進(jìn)而導(dǎo)致的動(dòng)脈壁異常膨出。煩內(nèi)動(dòng)脈瘤發(fā)病率較高，調(diào)查結(jié)果顯示，W先天性動(dòng) 脈瘤占大部分人群，40-66歲最為常見，約有10%的病人入院前死亡，尸體解剖檢出率約為 1-5%，煩內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂出血后30天的死亡率達(dá)45%，存活者中30%存在不同程度的殘疾， 此外仍約有500萬W上的隱匿性煩內(nèi)動(dòng)脈瘤未被發(fā)現(xiàn)和診斷，因此該疾病極為兇險(xiǎn)，嚴(yán)重 威脅人類的生命健康。我國屬煩內(nèi)動(dòng)脈瘤的高發(fā)地區(qū)，人群發(fā)病率達(dá)0. 1-4%。
[0003] 煩內(nèi)動(dòng)脈瘤的主要的治療手段包括開煩手術(shù)夾閉、血管內(nèi)介入治療、動(dòng)脈瘤包裹 及載瘤血管的閉塞或結(jié)扎，傳統(tǒng)的手術(shù)夾閉和血管內(nèi)介入治療是煩內(nèi)動(dòng)脈瘤的主要治療方 法。隨著介入醫(yī)學(xué)和材料學(xué)的發(fā)展，傳統(tǒng)的手術(shù)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)檠軆?nèi)介入治療，并成為煩內(nèi)動(dòng) 脈瘤的首選治療手段。動(dòng)脈瘤的血管介入治療主要包括單純彈黃圈栓塞、球囊輔助劑支架 輔助的彈黃圈栓塞。隨著材料學(xué)和治療理念的更新，血管介入治療從簡單的彈黃圈栓塞轉(zhuǎn) 變?yōu)檠髦亟ㄖ委?。通過在載瘤動(dòng)脈內(nèi)放置一血流重建裝置，為新生內(nèi)膜生長提供支撐，隨 后通過新生內(nèi)膜完全隔絕動(dòng)脈瘤。雖然血流重建裝置能夠很好地治療煩內(nèi)動(dòng)脈瘤，特別是 巨大動(dòng)脈瘤，但是目前仍面臨一些問題，如動(dòng)脈瘤的復(fù)發(fā)和再次破裂等。
[0004] 盡管煩內(nèi)動(dòng)脈瘤的治療有了長足的發(fā)展，但病人的預(yù)后仍然很差，其致死率高達(dá) 30-40 %。究其原因，除了疾病本身的臨床癥狀兇險(xiǎn)，治療風(fēng)險(xiǎn)大W外，疾病致病機(jī)制的不確 定是其主要原因。煩內(nèi)動(dòng)脈瘤的發(fā)病機(jī)制已經(jīng)爭論了許多年，但仍無定論，其可能與遺傳、。 由于疾病能使患者直接面對(duì)死亡的威脅，所W，弄清其病因和發(fā)展規(guī)律對(duì)于合理的選擇治 療方式至關(guān)重要。
[0005] 發(fā)明人對(duì)5例煩內(nèi)動(dòng)脈瘤病例組和3例對(duì)照組組織樣本進(jìn)行高通量測序，結(jié)合生 物信息學(xué)方法進(jìn)行基因篩選，在差異表達(dá)明顯的基因中挑選出低表達(dá)的候選基因0DAM，進(jìn) 一步，發(fā)明人進(jìn)行了分子驗(yàn)證，證實(shí)了 0DAM在煩內(nèi)動(dòng)脈瘤組中低表達(dá)。本發(fā)明提供了新的 煩內(nèi)動(dòng)脈瘤的監(jiān)測治療祀點(diǎn)，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種煩內(nèi)動(dòng)脈瘤診斷制劑，所述煩內(nèi)動(dòng)脈瘤診斷制劑檢測 0DAM基因和/或基因的表達(dá)產(chǎn)物。進(jìn)一步的，所述的0DAM基因和/或基因的表達(dá)產(chǎn)物在煩 內(nèi)動(dòng)脈瘤組織中低表達(dá)。
[0007] 進(jìn)一步，所述煩內(nèi)動(dòng)脈瘤診斷制劑采用巧光定量PCR試劑盒、基因忍片、免疫方法 檢測煩內(nèi)動(dòng)脈瘤組織中0DAM基因的表達(dá)。優(yōu)選的，所述的巧光定量PCR試劑盒中含有一對(duì) 特異性擴(kuò)增0DAM基因的引物；所述的基因忍片中包括與0DAM基因的核酸序列雜交的探針。 更優(yōu)選的，巧光定量PCR試劑盒內(nèi)含有特異性檢測ODAM基因的上游引物和下游引物，上游 引物序列為SEQIDNO. 1，下游引物序列為SEQIDNO. 2。
[0008] 進(jìn)一步，所述的煩內(nèi)動(dòng)脈瘤的診斷制劑采用免疫方法檢測煩內(nèi)動(dòng)脈瘤組織中ODAM基因的表達(dá)產(chǎn)物。優(yōu)選的，所述免疫方法為化ISA檢測和/或膠體金檢測。進(jìn)一步，所述 檢測0DAM蛋白的化ISA法為使用ELISA檢測試劑盒。所述試劑盒中的抗體可采用市售的 0DAM單克隆抗體或多克隆抗體。進(jìn)一步，所述的試劑盒包括：包被0DAM抗體的固相載體， 酶標(biāo)抗體，酶的底物，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，陰性對(duì)照品，稀釋液，洗涂液，酶反應(yīng)終止液等。
[0009] 進(jìn)一步，所述檢測0DAM蛋白的膠體金法為使用檢測試劑盒，所述的抗體可采用市 售的0DAM單克隆抗體或多克隆抗體。進(jìn)一步，所述的膠體金檢測試劑盒采用膠體金免疫層 析技術(shù)或膠體金滲濾法。進(jìn)一步，所述的膠體金檢測試劑盒硝酸纖維素膜上的檢測區(qū)燈） 噴點(diǎn)有抗0DAM抗體、質(zhì)控區(qū)（C)噴點(diǎn)有免疫球蛋白IgG。
[0010] 優(yōu)選的，檢測樣本為動(dòng)脈瘤壁組織和/或外周血。
[0011] 本發(fā)明的目的在于提供上述煩內(nèi)動(dòng)脈瘤診斷制劑在制備煩內(nèi)動(dòng)脈瘤診斷工具中 的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明的目的在于提供一種治療煩內(nèi)動(dòng)脈瘤的制劑，所述制劑中含有促進(jìn)0DAM 基因的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)的試劑或化合物。優(yōu)選的，制劑中含有藥劑學(xué)可接受的載體。
[0013] 進(jìn)一步的，所述的0DAM基因和/或基因的表達(dá)產(chǎn)物在煩內(nèi)動(dòng)脈瘤組織中低表達(dá)。
[0014] 本領(lǐng)域人員熟知促進(jìn)基因及其表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)通常可W采用下述方法中的一種 和/或幾種：激活分子標(biāo)志物的啟動(dòng)子、激活分子標(biāo)志物表達(dá)的蛋白或因子、導(dǎo)入促進(jìn)分子 標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄或表達(dá)的載體。
[0015]優(yōu)選的，所述治療煩內(nèi)動(dòng)脈瘤的制劑中含有促進(jìn)0DAM基因的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)的載體 和/或激活0DAM基因的啟動(dòng)子和/或激活0DAM基因表達(dá)的蛋白或因子。
[0016] 本發(fā)明的目的在于提供上述治療煩內(nèi)動(dòng)脈瘤的制劑在制備煩內(nèi)動(dòng)脈瘤治療藥物 或試劑中的應(yīng)用。
[0017]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先通過高通量測序結(jié)合生物信息學(xué)方法篩選到候選基 因0DAM基因，進(jìn)而通過分子生物學(xué)方法驗(yàn)證了 0DAM基因與煩內(nèi)動(dòng)脈瘤的關(guān)系：0DAM基因 與煩內(nèi)動(dòng)脈瘤具有很好的相關(guān)性，可用于制備煩內(nèi)動(dòng)脈瘤輔助診斷制劑，具有重要的臨床 應(yīng)用價(jià)值。
[0018] 巧光定量PCR法是通過巧光染料或巧光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo) 記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可W對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測樣品模板 的初始濃度。巧光定量PCR的出現(xiàn)，極大地簡化了定量檢測的過程，而且真正實(shí)現(xiàn)了絕對(duì)定 量。多種檢測系統(tǒng)的出現(xiàn)，使實(shí)驗(yàn)的選擇性更強(qiáng)。自動(dòng)化操作提高了工作效率，反應(yīng)快速、 重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果清晰。
[0019] 基因忍片又稱為DNA微陣列值NAmicroarray)，可分為Ξ種主要類型：1)固定在 聚合物基片（尼龍膜，硝酸纖維膜等）表面上的核酸探針或cDNA片段，通常用同位素標(biāo)記 的祀基因與其雜交，通過放射顯影技術(shù)進(jìn)行檢測。2)用點(diǎn)樣法固定在玻璃板上的DNA探針 陣列，通過與巧光標(biāo)記的祀基因雜交進(jìn)行檢測。3)在玻璃等硬質(zhì)表面上直接合成的寡核巧 酸探針陣列，與巧光標(biāo)記的祀基因雜交進(jìn)行檢測?；蛉唐鳛橐环N先進(jìn)的、大規(guī)模、高通 量檢測技術(shù)，應(yīng)用于疾病的診斷，其優(yōu)點(diǎn)有W下幾個(gè)方面：一是高度的靈敏性和準(zhǔn)確性；二 是快速簡便；Ξ是可同時(shí)檢測多種疾病。
[0020] 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)巧LISA)即將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標(biāo) 記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行的技術(shù)。該技術(shù)可用于檢測大分子抗原和特異性抗體 等，具有快速、靈敏、簡便、載體易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)。ELISA檢測試劑盒根據(jù)檢測目的和操作 步驟可分為間接法、雙抗夾屯、法、競爭法、雙位點(diǎn)一步法、捕獲法測IgM抗體、應(yīng)用親和素和 生物素的化ISA。ELISA檢測試劑盒中生色底物可選擇辣根過氧化物酶（HR巧或者堿性憐 酸酶（AF0。
[0021] 常用的免疫膠體金檢測技術(shù)：（1)免疫膠體金光鏡染色法細(xì)胞懸液涂片或組織切 片，可用膠體金標(biāo)記的抗體進(jìn)行染色，也可在膠體金標(biāo)記的基礎(chǔ)上，W銀顯影液增強(qiáng)標(biāo)記， 使被還原的銀原子沉積于已標(biāo)記的金顆粒表面，可明顯增強(qiáng)膠體金標(biāo)記的敏感性。（2)免疫 膠體金電鏡染色法可用膠體金標(biāo)記的抗體或抗抗體與負(fù)染病毒樣本或組織超薄切片結(jié)合， 然后進(jìn)行負(fù)染?？捎糜诓《拘螒B(tài)的觀察和病毒檢測。（3)斑點(diǎn)免疫金滲濾法應(yīng)用微孔濾膜 作載體，先將抗原或抗體點(diǎn)于膜上，封閉后加待檢樣本，洗涂后用膠體金標(biāo)記的抗體檢測相 應(yīng)的抗原或抗體。（4)膠體金免疫層析法將特異性的抗原或抗體W條帶狀固定在膜上，膠 體金標(biāo)記試劑（抗體或單克隆抗體）吸附在結(jié)合墊上，當(dāng)待檢樣本加到試紙條一端的樣本 墊上后，通過毛細(xì)作用向前移動(dòng)，溶解結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記試劑后相互反應(yīng)，當(dāng)移動(dòng)至固 定的抗原或抗體的區(qū)域時(shí)，待檢物與金標(biāo)試劑的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留， 聚集在檢測帶上，可通過肉眼觀察到顯色結(jié)果。該法現(xiàn)已發(fā)展成為診斷試紙條，使用十分方 便。
[0022] 本發(fā)明的藥劑學(xué)上可接受的載體為在制劑時(shí)通常利用的載體，該載體包含乳糖 (lactose)、右旋糖（dextrose)、薦糖（sucrose)、山梨醇（sorbitol)、甘露醇（mannitol)、 淀粉、阿拉伯橡膠、憐酸巧、藻酸鹽（alginate)、凝膠（gelatin)、娃酸巧、微晶纖維素、聚乙 締R比咯燒酬（polyvinylpyrrolidone)、纖維素（cellulose)、水、糖漿、甲基纖維素（methyl cellulose)、徑基苯甲酸甲醋（methylhy化oxybenzoate)、丙基徑基苯甲酸丙醋（propyl hy化oxybenzoate)、滑石、硬脂酸儀（stearicacidma即esium)及礦物油（mineraloil) 等，但并非局限于此。
[0023]本發(fā)明的藥劑學(xué)可接