包含修飾鉸鏈區(qū)的IgG4FC片段的制作方法
【專利說明】包含修飾鉸鏈區(qū)的lgG4FC片段
[技術(shù)領(lǐng)域]
[0001] 本發(fā)明涉及可用作藥物載體的IgG4Fc片段，更具體地涉及可以最小化Fc的效應(yīng) 子功能（effector functions)，但不引起與體內(nèi)IgG進(jìn)行鏈交換，并且可以提高綴合藥物 的體內(nèi)半衰期的IgG4Fc片段。
[【背景技術(shù)】]
[0002] 遺傳工程技術(shù)的進(jìn)步已經(jīng)造就各種蛋白質(zhì)藥物的制造和使用。但是，蛋白質(zhì)藥物 的致命問題在于，其因體內(nèi)蛋白酶而容易變性或容易分解，因此無法長時(shí)間維持其體內(nèi)濃 度和滴定度。因此，為了給患者提供有效治療同時(shí)減少患者接受通過注射等進(jìn)行的頻繁蛋 白質(zhì)供應(yīng)的負(fù)擔(dān)和其費(fèi)用，通過增加蛋白質(zhì)穩(wěn)定性使蛋白質(zhì)藥物的血液和體內(nèi)濃度維持在 適當(dāng)水平是非常重要的。
[0003] 因此，為提高蛋白質(zhì)藥物的體內(nèi)穩(wěn)定性，長久以來已做過很多嘗試一一通過改變 蛋白質(zhì)的制劑類型、與其它蛋白質(zhì)融合、或通過化學(xué)或生物學(xué)方法將合適的聚合物附著于 蛋白質(zhì)表面上。
[0004] 其中一種通過與其它蛋白質(zhì)融合來提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的嘗試是進(jìn)行免疫球蛋白 Fc和蛋白質(zhì)之間的融合。
[0005] Fc區(qū)，除抗原結(jié)合能力（免疫球蛋白的主要功能）之外，還負(fù)責(zé)效應(yīng)子功能，如補(bǔ) 體依賴性細(xì)胞毒性（CDC)和抗體依賴性細(xì)胞毒性（ADCC)。此外，存在于Fc區(qū)的FcRn序列 具有通過綴合至體內(nèi)FcRn受體來增加體內(nèi)半衰期而調(diào)節(jié)血清中的IgG水平的作用。關(guān)于 這點(diǎn)，已經(jīng)通過Fc區(qū)與治療性蛋白質(zhì)之間的融合進(jìn)行了積極的研究來改良治療性蛋白質(zhì)。
[0006] 但是，通過遺傳重組產(chǎn)生的Fc融合蛋白的缺點(diǎn)在于：蛋白質(zhì)融合僅在Fc區(qū)的特定 區(qū)域可能發(fā)生，即氨基末端或羧基末端，且僅在糖基化蛋白質(zhì)之間或非糖基化蛋白質(zhì)之間 可能發(fā)生，但在糖基化蛋白質(zhì)和非糖基化蛋白質(zhì)之間不可能發(fā)生。此外，通過遺傳重組產(chǎn)生 的Fc融合蛋白的問題在于：由于通過融合新產(chǎn)生的氨基酸序列可導(dǎo)致免疫應(yīng)答發(fā)生，以及 蛋白酶對連接體區(qū)域的敏感性可能增加。
[0007] 此外，F(xiàn)c融合蛋白具有增強(qiáng)的靶蛋白血清半衰期，但同時(shí)其也存在問題：Fc區(qū)具 有的效應(yīng)子功能顯現(xiàn)（美國專利號5, 349, 053)。通過Fc區(qū)的效應(yīng)子功能，融合蛋白可以固 著補(bǔ)體或結(jié)合至FcRs表達(dá)細(xì)胞以破壞特定細(xì)胞，和誘導(dǎo)引發(fā)炎癥的多種細(xì)胞因子生成和 分泌，從而引發(fā)炎癥。另外，融合區(qū)域中的蛋白質(zhì)序列是在人體中不存在的新蛋白質(zhì)序列， 因此其具有多種缺點(diǎn)，包括在長期施用的情況下可能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
[0008] 因此，研究已致力于采用其中效應(yīng)物功能被刪除同時(shí)血清半衰期得到保持的免疫 球蛋白或免疫球蛋白片段。Cole等先前報(bào)道，通過用丙氨酸取代CH2結(jié)構(gòu)域中的第234、235 和237位殘基（已知其在結(jié)合Fc受體方面具有重要作用）來抑制ADCC活性，以生產(chǎn)Fc受 體親和力降低的Fc衍生物，（Cole等，J. Immunol. 159 :3613-3621，1997)。但是，所有的這 些都具有不適合的、與天然人Fc區(qū)不同的氨基酸，因此可具有更高的免疫性或抗原性，并 且優(yōu)選的Fc功能可能喪失。
[0009] 作為在保持高血濃度免疫球蛋白的同時(shí)去除或減少不需要的效應(yīng)子功能的方法， 一種去除免疫球蛋白中的糖類的方法得到研究。在美國專利號5, 585, 097中，通過在制備 CD3抗體時(shí)使CH2結(jié)構(gòu)域的第297位天冬酰胺殘基（CD3抗體的糖基化殘基）被另一氨基酸 取代，制備了非糖基化的抗體衍生物，并且具體地，該衍生物顯示出降低的效應(yīng)子功能，同 時(shí)保持與FcRn受體的結(jié)合力，并且不改變其血清半衰期。但是，該方法也存在問題，由于新 的重組構(gòu)建體生成，其可能被免疫系統(tǒng)識別為外來物質(zhì)并因此被免疫系統(tǒng)排斥。
[0010] 在利用天然IgG Fc的序列制備融合蛋白質(zhì)時(shí)，可選擇IgG4Fc，以最小化Fc的效 應(yīng)子功能。已知IgG4具有與IgGl相似的體內(nèi)半衰期，但由于氨基酸序列差異而具有相對 小的效應(yīng)子功能。然而，盡管IgG4具有效應(yīng)子功能降低的優(yōu)勢，但由于其獨(dú)特的鉸鏈序 列，IgG4之間可發(fā)生體內(nèi)鏈交換，因此據(jù)報(bào)道，將融合蛋白質(zhì)用于治療目的時(shí)存在很大困 難（van der Neut Kolfschoten 等，Science, 317:1554-1557, 2007)。也就是說，存在如下 問題：當(dāng)IgG4Fc被用作蛋白質(zhì)融合的載體時(shí)，與體內(nèi)存在的IgG4發(fā)生鏈交換，從而與天然 IgG4形成雜合體，或者其可以單體形式存在，從而改變原始結(jié)構(gòu)并具有低治療活性的結(jié)構(gòu)。 通過遺傳工程或在體外是否生成IgG4Fc片段和生理活性物質(zhì)之間的融合產(chǎn)物是一個(gè)普遍 問題。
[
【發(fā)明內(nèi)容】
]
[0011] [技術(shù)問題]
[0012] 在這種情況下，基于研發(fā)能夠充當(dāng)藥物載體的、誘導(dǎo)與體內(nèi)IgG的Fab臂交換反應(yīng) (exchange反應(yīng)）和效應(yīng)子功能的風(fēng)險(xiǎn)低、同時(shí)能夠克服遺傳重組融合技術(shù)的缺點(diǎn)的IgG Fc片段的研究，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在大腸桿菌（E. coli)中生成經(jīng)突變僅具有一個(gè)半胱氨酸殘 基的IgG4Fc片段鉸鏈序列并使之與藥物綴合時(shí)，可形成具有耐久性提高而無誘導(dǎo)與體內(nèi) IgG的Fab臂交換反應(yīng)和效應(yīng)子功能的風(fēng)險(xiǎn)的藥物綴合物，從而完成本發(fā)明。
[0013] [技術(shù)方案]
[0014] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供IgG4Fc片段，其誘導(dǎo)與體內(nèi)IgG的鏈交換反應(yīng)或效應(yīng)子 功能的風(fēng)險(xiǎn)低，并且可以充當(dāng)藥物載體。更具體地，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供修飾的IgG4Fc 片段，其包含修飾的鉸鏈區(qū)，其中部分鉸鏈序列被刪除，而僅包括一個(gè)半胱氨酸殘基。.
[0015] 本發(fā)明的另一目的是提供核酸，其編碼包含修飾鉸鏈區(qū)的修飾IgG4Fc片段，其中 部分鉸鏈序列被刪除，從而僅包括一個(gè)半胱氨酸殘基。
[0016] 本發(fā)明的又一目的是提供載體，其包含編碼包含修飾鉸鏈區(qū)的修飾IgG4Fc片段 的核酸，其中部分鉸鏈序列被刪除，從而僅包括一個(gè)半胱氨酸殘基。
[0017] 本發(fā)明的又一目的是提供微生物，該微生物其中引入包括編碼包含修飾鉸鏈區(qū)的 修飾IgG4Fc片段的核酸的載體，其中部分鉸鏈序列被刪除，從而僅包括一個(gè)半胱氨酸殘 基。
[0018] 本發(fā)明的又一目的是提供制備修飾IgG4Fc片段的方法，包括培養(yǎng)引入了載體的 微生物，所述載體包括編碼修飾IgG4Fc片段的核酸。
[0019] 本發(fā)明的又一目的是提供藥物綴合物，其中藥物和修飾IgG4Fc片段通過連接體 綴合。
[0020] 本發(fā)明的又一目的是提供包含藥物綴合物的藥物組合物，其中藥物和修飾IgG4Fc 片段通過連接體綴合。
[0021] [發(fā)明的有利效果]
[0022] 本發(fā)明可提供修飾的IgG4Fc片段，其在沒有氨基酸取代或添加或聚糖添加的情 況下具有最小化的效應(yīng)子功能，并且與體內(nèi)IgG4無鏈交換反應(yīng)。本發(fā)明的修飾IgG4Fc片 段與其綴合至藥物的方法（如遺傳工程法和體外共價(jià)法）無關(guān)，在其綴合至藥物時(shí)，可抑制 綴合藥物的體內(nèi)鏈交換反應(yīng)，因此與天然IgG4Fc片段相比，可以提供顯著的治療優(yōu)越性。
[0023] [附圖簡述]
[0024] 圖1顯示大鼠血液中是否存在生物素化hIgG4和人粒細(xì)胞集落刺激因 子-PEG-IgG4Fc片段之間的人IgG4鏈交換。
[0025] 圖2顯示人血液中是否存在生物素化hIgG4和人粒細(xì)胞集落刺激因 子-PEG-IgG4Fc片段之間的人IgG4鏈交換。
[0026][最佳實(shí)施方式]
[0027] 下面將參考附圖對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行更加詳細(xì)的描述。但是，本發(fā)明可 以不同形式實(shí)施，不應(yīng)被解釋為限制于本文所示的實(shí)施方式。相反，這些實(shí)施方式被提供， 使得本公開是透徹而完整的，并且向本領(lǐng)域技術(shù)人員充分傳達(dá)本發(fā)明的范圍。
[0028] 在實(shí)現(xiàn)上述目的的方面，本發(fā)明提供可用作藥物載體的修飾IgG4Fc片段。更具體 地，本發(fā)明提供包含修飾鉸鏈區(qū)的修飾IgG4Fc片段，其中部分鉸鏈序列被刪除，從而僅包 括一個(gè)半胱氨酸殘基。
[0029] 本發(fā)明的修飾IgG4Fc片段包括修飾鉸鏈區(qū)，其中由下列氨基酸序列表示的鉸鏈 區(qū)部分被刪除，從而僅包括一個(gè)半胱氨酸殘基：
[0030] Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro(SEQ ID N0：1).
[0031] 在爭取解決IgG4Fc片段由于與體內(nèi)IgG4的鏈交換反應(yīng)而具有低效用的問題時(shí)， 盡管其作為載體增加藥物半衰期的效用，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)通過刪除從IgG4Fc片段的鉸鏈 區(qū)中存在的兩個(gè)半胱氨酸殘基中去除一個(gè)半胱氨酸殘基以及部分鉸鏈區(qū)來修飾IgG4Fc片 段時(shí)，不發(fā)生體內(nèi)鏈交換反應(yīng)和單體形成，從而確認(rèn)修飾的IgG4Fc片段可以有效地用作藥 物載體。
[0032] 在實(shí)施方式中，本發(fā)明的IgG4Fc片段可包括修飾的鉸鏈區(qū)，所述修飾通過刪除 SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的包括第8位Cys殘基的1至8個(gè)氨基酸進(jìn)行。
[0033] 另外，在實(shí)施方式中，本發(fā)明的IgG4Fc片段可包括修飾的鉸鏈區(qū)，所述修飾通過 刪除SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的包括第11位Cys殘基的1至8個(gè)氨基酸進(jìn)行。
[0034] 可選地，在實(shí)施方式中，本發(fā)明的IgG4Fc片段可包括修飾的鉸鏈區(qū)，所述修飾通 過刪除SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的包括第8位Cys殘基的1至5個(gè)氨基酸、或SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的包括第11位Cys殘基的1至5個(gè)氨基酸進(jìn)行。
[0035] 可選地，在實(shí)施方式中，本發(fā)明的IgG4Fc片段可包括修飾的鉸鏈區(qū)，所述修飾通 過刪除SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的包括第8位半胱氨酸殘基的1至3個(gè)氨基酸、或SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的包括第11位半胱氨酸殘基的1至3個(gè)氨基酸進(jìn)行。
[0036] 以上刪除的氨基酸殘基可以是連續(xù)的或不連續(xù)的。
[0037] 本發(fā)明的IgG4Fc片段的鉸鏈區(qū)的特征在于，其經(jīng)修飾僅包括SEQ ID NO: 1的氨基 酸序列的第8位和第11位的兩個(gè)半胱氨酸殘基之間的一個(gè)半胱氨酸殘基，以及兩個(gè)半胱氨 酸殘基沒都被去除。
[0038] 經(jīng)修飾僅包括鉸鏈區(qū)內(nèi)的兩個(gè)半胱氨酸殘基中的一個(gè)半胱氨酸殘基的鉸鏈區(qū)使 修飾的IgG4Fc片段在無體內(nèi)鏈交換、單體形成等的情況下具有效果。
[0039] 如本文所用，術(shù)語"載體"(carrier)是指綴合至藥物以及正要綴合至藥物的物質(zhì)， 其通常增加或去除藥物的生