抑制血管內(nèi)皮脂肪酶的酶活性的單克隆抗體的制作方法
【專利說明】抑制血管內(nèi)皮脂肪酶的酶活性的單克隆抗體
[0001] 【技術(shù)領(lǐng)域】 本發(fā)明涉及抑制血管內(nèi)皮脂肪酶（Endothelial Lipase，下文有時簡稱為EL))的活性 的單克隆抗體和含有所述抗體的藥物組合物。具體地，本發(fā)明涉及選擇性抑制EL的酶活性 的單克隆抗體或其部分、或含有所述抗體或其部分的藥物組合物。
[0002] 【【背景技術(shù)】】 EL是屬于甘油三酯脂肪酶（下文稱為TG)家族的磷脂酶（非專利文獻1)。人EL由 500個殘基（NCBI登錄號NP_006024. 1，序列編號：1)的氨基酸組成。人以外的哺乳動物的 EL已知例如兔EL (NCBI登錄號ΝΡ_001182567. 1)、食蟹猴EL (NCBI登錄號EHH61805. 1)、狒 狒 EL(NCBI 登錄號 XP_003914420. 1)、小鼠 EL(NCBI 登錄號 NP_034850. 3)等。TG 家族中包 含脂蛋白脂肪酶（下文稱為LPL)和肝脂酶（下文稱為HL)。
[0003] 根據(jù)EL敲除小鼠和EL轉(zhuǎn)基因小鼠的分析表明，EL通過其強磷脂酶活性與HDL膽 固醇（下文稱為HDL-c)的代謝相關(guān)，且作為限定血中HDL-c量的因子受到關(guān)注（非專利文 獻2)。一直以來已知，冠狀動脈疾?。ㄏ挛姆Q為CAD)與血中HDL-c量呈負相關(guān)關(guān)系。HDL-c 通過抗氧化作用、抗炎癥作用、膽固醇逆輸送作用等顯示抗動脈硬化作用，低HDL-c血癥識 別為CAD的風(fēng)險因子之一。因此，EL抑制劑通過增加血中HDL-c成為CAD治療藥，實際上 據(jù)報道，敲除了 EL的病態(tài)小鼠中HDL-c升高且動脈硬化病變部位減少（非專利文獻3)。
[0004] 這些發(fā)現(xiàn)顯示了，EL的選擇性抑制劑作為脂質(zhì)代謝異常和動脈硬化的治療藥的有 用性。
[0005] 選擇性抑制EL作為脂質(zhì)代謝異常和動脈硬化的治療藥是有用的，因此，抑制EL的 酶活性的EL的抗體的制備是重要的途徑之一。迄今報道了，制備從兔獲得的抑制EL酶活 性的多克隆抗體，通過向小鼠施用該抗體，升高血中HDL-c濃度（非專利文獻4)。
[0006] 但是，識別EL的多個部位的多克隆抗體對EL的抑制選擇性不高。另外，與EL有 關(guān)的諸如脂質(zhì)代謝異常和動脈硬化的慢性疾病的治療藥需要長期施用，因此，使用對人抗 原性高的兔多克隆抗體作為藥品是不可能的。而且，多克隆抗體也難以改善抗原性。
[0007] 由于這些情況，需要制備選擇性抑制EL的酶活性的單克隆抗體。
[0008] 【現(xiàn)有技術(shù)文獻】 【非專利文獻】 【非專利文獻1】 Nature Genetics、1999 年、第 21 卷、424 頁 【非專利文獻2】 TCM、第 14 卷、第 5 號、2004 年、P. 202-206 【非專利文獻3】 The Journal of Biological Chemistry Vo 1. 279, No.43， 22， 45085-45092， 2004 【非專利文獻4】 J Clin Invest、2003 年、第 111 卷第 3 號、357 頁。
[0009] 【發(fā)明概述】 【發(fā)明要解決的課題】 本發(fā)明要解決的課題是，提供選擇性抑制EL的酶活性的單克隆抗體或其抗體片段或 含有它們的藥物組合物。
[0010] 【解決課題的手段】 本發(fā)明人進行努力研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)選擇性抑制EL的酶活性的單克隆抗體，從而完成本 發(fā)明。
[0011] 即，本發(fā)明涉及： (1) 抑制血管內(nèi)皮脂肪酶的酶活性的單克隆抗體或其抗體片段，其識別序列編號1所 示氨基酸序列的1位至157位中的至少1個氨基酸， (2) 前述（1)中記載的單克隆抗體或其抗體片段，其識別序列編號1所示氨基酸序列的 50位至100位中的至少1個氨基酸， (3) 前述（1)或（2)中記載的單克隆抗體或其抗體片段，其識別序列編號1所示氨基酸 序列的50位的精氨酸、60位的谷氨酸、61位的組氨酸、65位的酪氨酸、100位的天冬酰胺中 的至少1個氨基酸， (4) 前述（1)或（2)中記載的單克隆抗體或其抗體片段，其至少識別序列編號1所示氨 基酸序列的65位的酪氨酸， (5) 前述（4)中記載的單克隆抗體或其抗體片段，其識別序列編號1所示氨基酸序列的 50位的精氨酸、52位的天冬酰胺、54位的精氨酸、58位的天冬氨酸、60位的谷氨酸、61位的 組氨酸、63位的甘氨酸、100位的天冬酰胺中的至少1個氨基酸， (6) 抑制血管內(nèi)皮脂肪酶的酶活性的單克隆抗體或其抗體片段，其識別序列編號1所 示氨基酸序列的202位至305位中的至少1個氨基酸， (7) 前述（6)中記載的單克隆抗體或其抗體片段，其識別序列編號1所示氨基酸序列的 220位至273位中的至少1個氨基酸， (8) 前述（6)或（7)中記載的單克隆抗體或其抗體片段，其識別序列編號1所示氨基 酸序列的220位的組氨酸、221位的蘇氨酸、222位的酪氨酸、223位的蘇氨酸、224位的精氨 酸、226位的苯丙氨酸、227位的甘氨酸、231位的甘氨酸、232位的異亮氨酸、233位的谷氨酰 胺、234位的蛋氨酸、240位的天冬氨酸、242位的酪氨酸、243位的脯氨酸、244位的天冬酰 胺、246位的甘氨酸、249位的谷氨酰胺、250位的脯氨酸、251位的甘氨酸、254位的亮氨酸、 258位的亮氨酸、263位的酪氨酸、269位的纈氨酸、273位的谷氨酸中的至少1個氨基酸， (9) 前述（6)或（7)中記載的單克隆抗體或其抗體片段，其識別序列編號1所示氨基酸 序列的220位的組氨酸、221位的蘇氨酸、240位的天冬氨酸、242位的酪氨酸、243位的脯氨 酸、244位的天冬酰胺、246位的甘氨酸、249位的谷氨酰胺、250位的脯氨酸、251位的甘氨酸 中的至少1個氨基酸， (10) 前述（6)或（7)中記載的單克隆抗體或其抗體片段，其識別序列編號1所示氨基 酸序列的220位的組氨酸、221位的蘇氨酸、240位的天冬氨酸、242位的酪氨酸、243位的脯 氨酸、244位的天冬酰胺、246位的甘氨酸、249位的谷氨酰胺、250位的脯氨酸、251位的甘氨 酸中的全部氨基酸， (11) 前述（1)至（10)任一項中記載的單克隆抗體或其抗體片段，其以IOnM以下的 IC50抑制血管內(nèi)皮脂肪酶， (12) 前述（11)中記載的單克隆抗體或其抗體片段，其以5nM以下的IC50抑制血管內(nèi) 皮脂肪酶， (13) 前述（11)中記載的單克隆抗體或其抗體片段，其以2nM以下的IC50抑制血管內(nèi) 皮脂肪酶， (14) 抗體或其抗體片段，選自： 1) 單克隆抗體或其抗體片段，其具有： 包含具有序列編號10、序列編號11和序列編號12的氨基酸序列的3個CDR的重鏈可 變區(qū)、以及 包含具有序列編號14、序列編號15和序列編號16的氨基酸序列的3個CDR的輕鏈可 變區(qū)， 2) 單克隆抗體或其抗體片段，其具有： 包含具有序列編號10、序列編號11和序列編號12的氨基酸序列的3個CDR的重鏈可 變區(qū)、以及 包含3個CDR的輕鏈可變區(qū)，所述3個CDR由下列氨基酸序列組成：在具有序列編號 14、序列編號15和序列編號16的氨基酸序列的3個⑶R中的1個以上⑶R中1個或多個 氨基酸被缺失、置換或添加而成的氨基酸序列，和 其抑制血管內(nèi)皮脂肪酶的酶活性， 3) 單克隆抗體或其抗體片段，其具有： 包含3個CDR的重鏈可變區(qū)，所述3個CDR由下列氨基酸序列組成：在具有序列編號 10、序列編號11和序列編號12的氨基酸序列的3個⑶R中的1個以上⑶R中1個或多個 氨基酸被缺失、置換或添加而成的氨基酸序列，以及 包含具有序列編號14、序列編號15和序列編號16的氨基酸序列的3個CDR的輕鏈可 變區(qū)，和 其抑制血管內(nèi)皮脂肪酶的酶活性， 4) 單克隆抗體或其抗體片段，其具有： 包含3個CDR的重鏈可變區(qū)，所述3個CDR由下列氨基酸序列組成：在具有序列編號 10、序列編號11和序列編號12的氨基酸序列的3個⑶R中的1個以上⑶R中1個或多個 氨基酸被缺失、置換或添加而成的氨基酸序列，以及 包含3個CDR的輕鏈可變區(qū)，所述3個CDR由下列氨基酸序列組成：在具有序列編號 14、序列編號15和序列編號16的氨基酸序列的3個⑶R中的1個以上⑶R中1個或多個 氨基酸被缺失、置換或添加而成的氨基酸序列，和 其抑制血管內(nèi)皮脂肪酶的酶活性， 5) 單克隆抗體或其抗體片段，其具有： 包含具有序列編號18、序列編號19和序列編號20的氨基酸序列的3個CDR的重鏈可 變區(qū)、以及 包含具有序列編號22、序列編號23和序列編號24的氨基酸序列的3個CDR的輕鏈可 變區(qū)， 6) 單克隆抗體或其抗體片段，其具有： 包含具有序列編號18、序列編號19和序列編號20的氨基酸序列的3個CDR的重鏈可 變區(qū)、以及 包含3個CDR的輕鏈可變區(qū)，所述3個CDR由下列氨基酸序列組成：在具有序列編號 22、序列編號23和序列編號24的氨基酸序列的3個⑶R中的1個以上⑶R中1個或多個 氨基酸被缺失、置換或添加而成的氨基酸序列，和 其抑制血管內(nèi)皮脂肪酶的酶活性， 7) 單克隆抗體或其抗體片段，其具有： 包含3個CDR的重鏈可變區(qū)，所述3個CDR由下列氨基酸序列組成：在具有序列編號 18、序列編號19和序列編號20的氨基酸序列的3個⑶R中的1個以上⑶R中1個或多個 氨基酸被缺失、置換或添加而成的氨基酸序列、以及 包含具有序列編號22、序列編號23和序列編號24的氨基酸序列的3個CDR的輕鏈可 變區(qū)，和 其抑制血管內(nèi)皮脂肪酶的酶活性， 8) 單克隆抗體或其抗體片段，其具有： 包含3個CDR的重鏈可變區(qū)，所述3個CDR由下列氨基酸序列組成：在具有序列編號 18、序列編號19和序列編號20的氨基酸序列的3個⑶R中的1個以上⑶R中1個或多個 氨基酸被缺失、置換或添加而成的氨基酸序列、以及 包含3個CDR的輕鏈可變區(qū)，所述3個CDR由下列氨基酸序列組成：在具有序列編號 22、序列編號23和序列編號24的氨基酸序列的3個⑶R中的1個以上⑶R中1個或多個 氨基酸被缺失、置換或添加而成的氨基酸序列，和 其抑制血管內(nèi)皮脂肪酶的酶活性， 9) 單克隆抗體或其抗體片段，其具有： 包含具有序列編號26、序列編號27和序列編號28的氨基酸序列的3個CDR的重鏈可 變區(qū)、以及 包含具有序列編號30、序列編號31和序列編號32的氨基酸序列的3個CDR的輕鏈可 變區(qū)， 10) 單克隆抗體或其抗體片段，其具有： 包含具有序列編號26、序列編號27和序列編號28的氨基酸序列的3個CDR的重鏈可 變區(qū)、以及 包含3個CDR的輕鏈可變區(qū)，所述3個CDR由下列氨基酸序列組成：在具有序列編號 30、序列編號31和序列編號32的氨基酸序列的3個⑶R中的1個以上⑶R中1個或多個 氨基酸被缺失、置換或添加而成的氨基酸序列，和 其抑制血管內(nèi)皮脂肪酶的酶活性， 11) 單克隆抗體或其抗體片段，其具有： 包含3個CDR的重鏈可變區(qū)，所述3個CDR由下列氨基酸序列組成：在具有序列編號 26、序列編號27和序列編號28的氨基酸序列的3個⑶R中的1個以上⑶R中1個或多個 氨基酸被缺失、置換或添加而成的氨基酸序列、以及 包含具有序列編號30、序列編號31和序列編號32的氨基酸序列的3個CDR的輕鏈可 變區(qū)，和 其抑制血管內(nèi)皮脂肪酶的酶活性， 12) 單克隆抗體或其抗體片段，其具有： 包含3個CDR的重鏈可變區(qū)，所述3個CDR由下列氨基酸序列組成：在具有序列編號 26、序列編號27和序列編號28的氨基酸序列的3個⑶R中的1個以上⑶R中1個或多個 氨基酸被缺失、置換或添加而成的氨基酸序列、以及 包含3個CDR的輕鏈可變區(qū)，所述3個CDR由下列氨基酸序列組成：在具有序列編號 30、序列編號31和序列編號32的氨基酸序列的3個⑶R中的1個以上⑶R中1個或多個 氨基酸被缺失、置換或添加而成的氨基酸序列，和 其抑制血管內(nèi)皮脂肪酶的酶活性， 13) 單克隆抗體或其抗體片段，其具有： 包含具有序列編號34、序列編號35和序列編號36的氨基酸序列的3個CDR的重鏈可 變區(qū)、以及 包含具有序列編號38、序列編號39和序列編號40的氨基酸序列的3個CDR的輕鏈可 變區(qū)， 14) 單克隆抗體或其抗體片段，其具有： 包含具有序列編號34、序列編號35和序列編號36的氨基酸序列的3個CDR的重鏈可 變區(qū)、以及 包含3個CDR的輕鏈可變區(qū)，所述3個CDR由下列氨基酸序列組成：在具有序列編號 38、序列編號39和序列編號40的氨基酸序列的3個⑶R中的1個以上⑶R中1個或多個 氨基酸被缺失、置換或添加而成的氨基酸序列，和 其抑制血管內(nèi)皮脂肪酶的酶活性， 15) 單克隆抗體或其抗體片段，其具有： 包含3個CDR的重鏈可變區(qū)，所述3個CDR由下列氨基酸序列組成：在具有序列編號 34、序列編號35和序列編號36的氨基酸序列的3個⑶R中的1個以上⑶R中1個或多個 氨基酸被缺失、置換或添加而成的氨基酸序列、以及 包含具有序列編號38、序列編號39和序列編號40的氨基酸序列的3個CDR的輕鏈可 變區(qū)，和 其抑制血管內(nèi)皮脂肪酶的酶活性， 16) 單克隆抗體或其抗體片段，其具有： 包含3個CDR的重鏈可變區(qū)，所述3個CDR由下列氨基酸序列組成：在具有序列編號 34、序列編號35和序列編號36的氨基酸序列的3個⑶R中的1個以上⑶R中1個或多個 氨基酸被缺失、置換或添加而成的氨基酸序列、以及 包含3個CDR的輕鏈可變區(qū)，所述3個CDR由下列氨基酸序列組成：在具有序列編號 38、序列編號39和序列編號40的氨基酸序列的3個⑶R中的1個以上⑶R中1個或多個 氨基酸被缺失、置換或添加而成的氨基酸序列，和 其抑制血管內(nèi)皮脂肪酶的酶活性， 17) 單克隆抗體或其抗體片段，其具有： 包含具有序列編號42、序列編號43和序列編號44的氨基酸序列的3個CDR的重鏈可 變區(qū)、以及 包含具有序列編號46、序列編號47和序列編號48的氨基酸序列的3個CDR的輕鏈可 變區(qū)， 18) 單克隆抗體或其抗體片段，其具有： 包含具有序列編號42、序列編號43和序列編號44的氨基酸序列的3個CDR的重鏈可 變區(qū)、以及 包含3個CDR的輕鏈可變區(qū)，所述3個CDR由下列氨基酸序列組成：在具有序列編號 46、序列編號47和序列編號48的氨基酸序列的3個⑶R中的1個以上⑶R中1個或多個 氨基酸被缺失、置換或添加而成的氨基酸序列，和 其抑制血管內(nèi)皮脂肪酶的酶活性， 19) 單克隆抗體或其抗體片段，其具有： 包含3個CDR的重鏈可變區(qū)，所述3個CDR由下列氨基酸序列組成：在具有序列編號 42、序列編號43和序列編號44的氨基酸序列的3個⑶R中的1個以上⑶R中1個或多個 氨基酸被缺失、置換或添加而成的氨基酸序列、以及 包含具有序列編號46、序列編號47和序列編號48的氨基酸序列的3個CDR的輕鏈可 變區(qū)，和 其抑制血管內(nèi)皮脂肪酶的酶活性， 20) 單克隆抗體或其抗體片段，其具有： 包含3個CDR的重鏈可變區(qū)，所述3個CDR由下列氨基酸序列組成：在具有序列編號 42、序列編號43和序列編號44的氨基酸序列的3個⑶R中的1個以上⑶R中1個或多個 氨基酸被缺失、置換或添加而成的氨基酸序列、以及 包含3個CDR的輕鏈可變區(qū)，所述3個CDR由下列氨基酸序列組成：在具有序列編號 46、序列編號47和序列編號48的氨基酸序列的3個⑶R中的1個以上⑶R中1個或多個 氨基酸被缺失、置換或添加而成的氨基酸序列，和 其抑制血管內(nèi)皮脂肪酶的酶活性， 21) 單克隆抗體或其抗體片段，其具有： 包含具有序列編號50、序列編號51和序列編號52的氨基酸序列的3個CDR的重鏈可 變區(qū)、以及 包含具有序列編號54、序列編號55和序列編號56的氨基酸序列的3個CDR的輕鏈可 變區(qū)， 22) 單克隆抗體或其抗體片段，其具有： 包含具有序列編號50、序列編號51和序列編號52的氨基酸序列的3個CDR的重鏈可 變區(qū)、以及 包含3個CDR的輕鏈可變區(qū)，所述3個CDR由下列氨基酸序列組成：在具有序列編號 54、序列編號55和序列編號56的氨基酸序列的3個⑶R中的1個以上⑶R中1個或多個 氨基酸被缺失、置換或添加而成的氨基酸序列，和 其抑制血管內(nèi)皮脂肪酶的酶活性， 23) 單克隆抗體或其抗體片段，其具有： 包含3個CDR的重鏈可變區(qū)，所述3個CDR由下列氨基酸序列組成：在具有序列編號 50、序列編號51和序列編號52的氨基酸序列的3個⑶R中的1個以上⑶R中1個或多個 氨基酸被缺失、置換或添加而成的氨基酸序列、以及 包含具有序列編號54、序列編號55和序列編號56的氨基酸序列的3個CDR的輕鏈可 變區(qū)，和 其抑制血管內(nèi)皮脂肪酶的酶活性， 24) 單克隆抗體或其抗體片段，其具有： 包含3個CDR的重鏈可變區(qū)，所述3個CDR由下列氨基酸序列組成：在具有序列編號 50、序列編號51和序列編號52的氨基酸序列的3個⑶R中的1個以上⑶R中1個或多個 氨基酸被缺失、置換或添加而成的氨基酸序列、以及 包含3個CDR的輕鏈可變區(qū)，所述3個CDR由下列氨基酸序列組成：在具有序列編號 54、序列編號55和序列編號56的氨基酸序列的3個⑶R中的1個以上⑶R中1個或多個 氨基酸被缺失、置換或添加而成的氨基酸序列，和 其抑制血管內(nèi)皮脂肪酶的酶活性， 25) 單克隆抗體或其抗體片段，其具有： 包含具有序列編號58、序列編號59和序列編號60的氨基酸序列的3個CDR的重鏈可 變區(qū)、以及 包含具有序列編號62、序列編號63和序列編號64的氨基酸序列的3個CDR的輕鏈可 變區(qū)， 26) 單克隆抗體或其抗體片段，其具有： 包含具有序列編號58、序列編號59和序列編號60的氨基酸序列的3個CDR的重鏈可 變區(qū)、以及 包含3個CDR的輕鏈可變區(qū)，所述3個CDR由下列氨基酸序列組成：在具有序列編號 62、序列編號63和序列編號64的氨基酸序列的3個⑶R中的1個以上⑶R中1個或多個 氨基酸被缺失、置換或添加而成的氨基酸序列，和 其抑制血管內(nèi)皮脂肪酶的酶活性， 27) 單克隆抗體或其抗體片段，其具有： 包含3個CDR的重鏈可變區(qū)，所述3個CDR由下列氨基酸序列組成：在具有序列編號 58、序列編號59和序列編號60的氨基酸序列的3個⑶R中的1個以上⑶R中1個或多個 氨基酸被缺失、置換或添加而成的氨基酸序列、以及 包含具有序列編號62、序列編號63和序列編號64的氨基酸序列的3個CDR的輕鏈可 變區(qū)，和 其抑制血管內(nèi)皮脂肪酶的酶活性， 28) 單克隆抗體或其抗體片段，其具有： 包含3個CDR的重鏈可變區(qū)，所述3個CDR由下列氨基酸序列組成：在具有序列編號 58、序列編號59和序列編號60的氨基酸序列的3個⑶R中的1個以上⑶R中1個或多個 氨基酸被缺失、置換或添加而成的氨基酸序列、以及 包含3個CDR的輕鏈可變區(qū)，所述3個CDR由下列氨基酸序列組成：在具有序列編號 62、序列編號63和序列編號64的氨基酸序列的3個⑶R中的1個以上⑶R中1個或多個 氨基酸被缺失、置換或添加而成的氨基酸序列，和 其抑制血管內(nèi)皮脂肪酶的酶活性， 29) 單克隆抗體或其抗體片段，其具有： 包含具有序列編號66、序列編號67和序列編號68的氨基酸序列的3個CDR的重鏈可 變區(qū)、以及 包含具有序列編號70、序列編號71和序列編號72的氨基酸序列的3個CDR的輕鏈可 變區(qū)， 30) 單克隆抗體或其抗體片段，其具有： 包含具有序列編號66、序列編號67和序列編號68的氨基酸序列的3個CDR的重鏈可 變區(qū)、以及 包含3個CDR的輕鏈可變區(qū)，所述3個CDR由下列氨基酸序列組成：在具有序列編號 70、序列編號71和序列編號72的氨基酸序列的3個⑶R中的1個以上⑶R中1個或多個 氨基酸被缺失、置換或添加而成的氨基酸序列，和 其抑制血管內(nèi)皮脂肪酶的酶活性， 31) 單克隆抗體或其抗體片段，其具有： 包含3個CDR的重鏈可變區(qū)，所述3個CDR由下列氨基酸序列組成：在具有序列編號 66、序列編號67和序列編號68的氨基酸序列的3個⑶R中的1個以上⑶R中1個或多個 氨基酸被缺失、置換或添加而成的氨基酸序列、以及 包含具有序列編號70、序列編號71和序列編號72的氨基酸序列的3個CDR的輕鏈可 變區(qū)，和 其抑制血管內(nèi)皮脂肪酶的酶活性， 32) 單克隆抗體或其抗體片段，其具有： 包含3個CDR的重鏈可變區(qū)，所述3個CDR由下列氨基酸序列組成：在具有序列編號 66、序列編號67和序列編號6