共交聯(lián)磷酸鹽化的和/或磷酸鹽官能化的聚多糖類(lèi)水凝膠的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基于透明質(zhì)酸的水凝膠領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明涉及通過(guò)透明質(zhì)酸與葡 聚糖的共交聯(lián)獲得的磷酸化水凝膠，及其制備方法。本發(fā)明還涉及所述水凝膠用于活性成 分和細(xì)胞的封裝和緩釋的用途，所述活性成分和細(xì)胞用于人類(lèi)和獸醫(yī)再生醫(yī)學(xué)。
【背景技術(shù)】
[0002] 玻尿酸或透明質(zhì)酸（CAS No. 9004-61-9,在本文中也縮寫(xiě)為HA)屬于粘多糖家族。 其為二糖聚合物，更具體地為線(xiàn)性非硫酸化粘多糖，其中包含通過(guò)交替的β_1，4和β-1，3 糖苷鍵結(jié)合在一起的葡萄糖醛和N-乙?；?D-葡糖胺D-酸的重復(fù)單元（參見(jiàn)Tammi 等人在 Progress in Histochemistry&Cytochemistry 雜志上發(fā)表的文南犬"Hyaluronan metabolism in skin"，29 (2): 1-81，1994)。
[0003] 透明質(zhì)酸發(fā)現(xiàn)于許多哺乳動(dòng)物的組織中，更具體地在細(xì)胞外組織基質(zhì)中。由于其 結(jié)合水分子的能力，其主要作用是組織的水合作用。如果其分子量超過(guò)約2MDa并且其質(zhì)量 分?jǐn)?shù)超過(guò)約0. 1 %，其會(huì)形成水凝膠；根據(jù)其分子量和質(zhì)量分?jǐn)?shù)，它以這種形式存在于某些 組織中，例如關(guān)節(jié)中，尤其是關(guān)節(jié)滑液中。它還具有其它作用，例如對(duì)諸如細(xì)胞迀移、組織分 化、血管再生和免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)等生物現(xiàn)象的調(diào)節(jié)作用。因此，現(xiàn)有技術(shù)基于其分子量將該分 子歸于完全不同的功能。
[0004] 透明質(zhì)酸在體內(nèi)經(jīng)一組酶（稱(chēng)為透明質(zhì)酸酶）分解（參見(jiàn)K. S. Girish和 K. Kemparaju 在 Life Sciences 雜志上發(fā)表的文章 "The magic glue hyaluronan and its eraser hyaluronidase:A biological overview"，80(2007 年），ρ· 1921 至 1943);也有其 它酶參與這一過(guò)程。
[0005] 基于透明質(zhì)酸的水凝膠是已知的，并且用于很多醫(yī)療應(yīng)用中，特別是以注射形式 用于皮膚重建、美容外科及皮膚科、或者用于軟骨和骨關(guān)節(jié)的重建的矯形術(shù)（例如，用于膝 關(guān)節(jié)的粘彈性補(bǔ)充治療）。它們也可以用作細(xì)胞培養(yǎng)基用于研究和細(xì)胞治療，或者用于化學(xué) 治療。
[0006] 根據(jù)其制備方法和用途，基于透明質(zhì)酸的可注射的水凝膠可以分為三種不同的類(lèi) 別：
[0007] - "導(dǎo)電"水凝膠，包含單獨(dú)的交聯(lián)透明質(zhì)酸（HA)或者與其它聚合物結(jié)合的透明質(zhì) 酸，用于在整容手術(shù)或粘彈性補(bǔ)充治療（體內(nèi)平衡的恢復(fù)）中填充皺紋；
[0008] - "誘導(dǎo)"水凝膠，包含交聯(lián)透明質(zhì)酸，含有生長(zhǎng)因子和/或其它所謂的生物活性分 子，用于在原位傳遞中控制它們；
[0009] -用于細(xì)胞移植的水凝膠，由多種組分構(gòu)成：聚合物、蛋白質(zhì)和細(xì)胞。
[0010] 對(duì)于人類(lèi)醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)學(xué)的用處，水凝膠必須滿(mǎn)足多種標(biāo)準(zhǔn)（參見(jiàn)Μ. Ν. Collins和 C. Birkinshaw發(fā)表的文章 "Hyaluronic acid base scaffolds for tissue engineering-A review"，Carbohydrate Polymers 92 (2013)，1262-1279, 2013 ;GD Prestwich 發(fā)表的文 章 "Hyaluronic acid-based clinical biomaterials derived for cell and molecule delivery in regenerative medicine'，，J. Controlled Release 155 (2011)，193-199) 〇 例 如，水凝膠必須是可生物降解的、生物相容的以及可再吸收的；而且它必須易于在生理?xiàng)l件 下使用。
[0011] 通常，術(shù)語(yǔ)"生物相容性"是指非生物材料與生物系統(tǒng)相互作用的這樣一種能力， 要求其通過(guò)對(duì)宿主具有適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)以滿(mǎn)足特定功能。
[0012] 長(zhǎng)期以來(lái)膠原蛋白（糖蛋白家族）被用作可再吸收的、可注射的填充物。然而，膠 原蛋白存在某些缺點(diǎn)，包括出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)、以及在體內(nèi)快速降解的風(fēng)險(xiǎn)。
[0013] 這些都是其被透明質(zhì)酸鹽替代的原因，無(wú)論其來(lái)源和制備方法（動(dòng)物、生物技 術(shù)），透明質(zhì)酸鹽沒(méi)有任何過(guò)敏反應(yīng)并且是生物相容的。
[0014] 當(dāng)前，透明質(zhì)酸水凝膠，特別是其鹽和/或衍生物，已廣泛應(yīng)用于化妝品領(lǐng)域，特 別是用于填充皺紋和皮膚缺損。
[0015] 透明質(zhì)酸及其鹽可以單獨(dú)用于水凝膠的制備，也可以與其它聚合物（膠原蛋白、 明膠、殼聚糖、硫酸軟骨素等等）組合使用，以促進(jìn)不同組分的協(xié)同作用，并且更可靠地模 擬細(xì)胞外基質(zhì)。
[0016] 由于沿著所述鏈存在的羧基、羥基和乙酰胺官能團(tuán)，透明質(zhì)酸可以經(jīng)化學(xué)改性。一 方面，這些基團(tuán)可以用于交聯(lián)；另一方面，這些基團(tuán)也可以用于官能化，以提供新的生物性 能或改善固有的生物和/或物理化學(xué)性質(zhì)。交聯(lián)涉及兩個(gè)多糖鏈之間和/或同一個(gè)鏈的兩 個(gè)部分之間鍵的形成。其導(dǎo)致粘度和/或分子量增加，并且驅(qū)動(dòng)其它物理和物理化學(xué)性質(zhì) 的改性。
[0017] 因此，由透明質(zhì)酸制備水凝膠具有多種可能性。
[0018] 文獻(xiàn)FR 2918377描述了一種粘性共交聯(lián)凝膠，其包含至少一個(gè)第一強(qiáng)交聯(lián)多糖 凝膠、和至少一個(gè)第二弱交聯(lián)多糖凝膠，所述第一凝膠通過(guò)共價(jià)鍵與第二凝膠結(jié)合。強(qiáng)交聯(lián) 凝膠和弱交聯(lián)凝膠優(yōu)選地基于透明質(zhì)酸鈉；交聯(lián)劑為1，4- 丁二醇二縮水甘油醚（BDDE)。
[0019] 文獻(xiàn)US 6586493描述了一種水凝膠，其得自包含部分不飽和多糖和非-血管生成 透明質(zhì)酸的混合物，所述部分不飽和多糖被交聯(lián)基團(tuán)取代。所述混合物的交聯(lián)是通過(guò)加入 自由基聚合引發(fā)劑（特別是苯乙酮（光引發(fā)劑））實(shí)現(xiàn)的。由于自由基聚合產(chǎn)生的大量降 解產(chǎn)物一旦形成就可能被限制在生成的水凝膠中，因此這個(gè)過(guò)程是非常不利的。
[0020] 本發(fā)明的目的是提供一種新的基于多糖的水凝膠，其對(duì)增加的降解具有良好的抵 抗性并且沒(méi)有細(xì)胞毒性，對(duì)于美容外科、皮膚科、眼科、骨科用于軟骨和骨關(guān)節(jié)重建、以及人 類(lèi)和獸醫(yī)再生醫(yī)學(xué)的用途而言，其是可注射的并且是生物相容的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0021] 本發(fā)明涉及共交聯(lián)的磷酸化多糖水凝膠，基于（i)葡聚糖和（ii)透明質(zhì)酸和/或 其鹽，任選地官能化的透明質(zhì)酸和/或其鹽，在水凝膠中所述葡聚糖和所述透明質(zhì)酸（和/ 或其鹽，任選地官能化的透明質(zhì)酸和/或其鹽）通過(guò)磷酸二酯和/或聚磷酸二酯共價(jià)鍵結(jié) 合在一起。
[0022] 有利的是，透明質(zhì)酸或其鹽，為由三偏磷酸鈉官能化的磷酰基透明質(zhì)酸（和/或其 鹽）。
[0023] 在本發(fā)明一個(gè)特定的實(shí)施方案中，三偏磷酸鈉官能化的透明質(zhì)酸（和/或其鹽） 中磷酸鹽的濃度介于0.0 lmEq/g至4mEq/g，更優(yōu)選地介于0.1 mEq/g至2mEq/g。
[0024] 在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，水凝膠中磷酸鹽的濃度介于0.1 mEq/g至3mEq/g，更 優(yōu)選地介于〇· ImEq/g至2mEq/g。
[0025] 本發(fā)明還涉及一種制備基于葡聚糖和透明質(zhì)酸的共交聯(lián)的磷酸化多糖水凝膠和/ 或其鹽（任選地官能化的）的方法，其中：
[0026] a)提供葡聚糖溶液；
[0027] b)通過(guò)向所述葡聚糖溶液中加入堿金屬氫氧化物溶液（例如氫氧化鈉），使得該 葡聚糖中的至少一個(gè)羥基被激活，從而得到活化的葡聚糖溶液；
[0028] c)向所述活化的葡聚糖溶液中加入三偏磷酸鈉；
[0029] d)向步驟c)中獲得的溶液中加入透明質(zhì)酸和/或其鹽，任選地官能化的透明質(zhì)酸 和/或其鹽。
[0030] 有利的是，同時(shí)進(jìn)行該方法的步驟c)和d)，將三偏磷酸鈉和透明質(zhì)酸（和/或其 一種鹽，任選地官能化的）同時(shí)添加至該方法步驟b)中獲得的溶液中。
[0031] 有利的是，在18至25°C的溫度下實(shí)施所述方法的步驟a)至d)。
[0032] 在該方法一個(gè)特定的實(shí)施方案中，步驟b)中加入的堿金屬氫氧化物的濃度介于 0.1 M至IM之間，優(yōu)選地介于0.1 M至0. 5M之間。
[0033] 在該方法另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，該方法步驟d)中加入的透明質(zhì)酸和/或其鹽 為用三偏磷酸鈉官能化的透明質(zhì)酸。
[0034] 有利的是，以粉末的形式添加透明質(zhì)酸和/或其鹽（任選地官能化的）。
[0035] 本發(fā)明還涉及用于制備藥物的本發(fā)明水凝膠，以及能夠通過(guò)本發(fā)明方法制得的水 凝膠，將單獨(dú)植入或與細(xì)胞（任選的干細(xì)胞）一起用于細(xì)胞療法；或者將以濕形式用于局部 應(yīng)用中；或者將用于運(yùn)送活性分子和活性成分，以及更具體的生長(zhǎng)因子，優(yōu)選的生長(zhǎng)因子選 自：成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGFs)、血小板源性生長(zhǎng)因子（PDGFs)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGFs)，血 管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vEGF)，骨誘導(dǎo)生長(zhǎng)因子（BMPs);或者將用于再生醫(yī)學(xué)中，并且更具體地 用于人類(lèi)和/或獸醫(yī)再生醫(yī)學(xué)。
[0036] 本發(fā)明的最終目的是本發(fā)明水凝膠用于骨傳導(dǎo)和/或骨誘導(dǎo)的用途，即其用于骨 再生的用途。
【附圖說(shuō)明】
[0037] 圖1至8闡明了本發(fā)明的某些方面。
[0038] 圖1為紅外光譜（IR)，其示出本發(fā)明方法（實(shí)施例1)中的反應(yīng)混合物在25°C下 從同時(shí)添加透明質(zhì)酸和三偏磷酸鈉 TMP開(kāi)始24小時(shí)內(nèi)的紅外曲線(xiàn)的變化（曲線(xiàn)a :添加后 22分鐘；曲線(xiàn)b :添加后32分鐘；曲線(xiàn)c :添加后42分鐘；曲線(xiàn)d :添加后52分鐘；曲線(xiàn)e : 添加后120分鐘；曲線(xiàn)f :添加后24小時(shí)得到的凝膠）。X軸表示波數(shù)，以cm 1為單位；y軸 表示透過(guò)率（以％表示，無(wú)量綱）。
[0039] 圖2的圖表示出堿金屬氫氧化物的濃度和三偏磷酸鈉的濃度對(duì)葡聚糖交聯(lián)的影 響。
[0040] 圖3為根據(jù)本發(fā)明制