量的足夠證據(jù)。
[0213] pH5. 5 下 Tf-DAK-PEG-OPSS 半衰期的評價：將 Tf-DAK-PEG-OPSS 在 37 °C 在 IOOmM NaOAc pH 5. 5中稀釋至lmg/mL。在多種時間點，等分試樣被取出，以1:10在IOmM NaH2P04pH8.0中稀釋并被凍存在干冰上。在最后等分試樣被取出之后，所有的樣品被融化 并立即使用芥子酸基質(zhì)通過MALDI-T0F來測量。
[0214] Tf-PEG-OPSS 的合成和純化：0PSS-PEG-NHS(5kDa，Laysan Bio)在 ImL IOOmM NaHCO3PH 8.5中以8x摩爾過量添加至人holo-Tf (20mg)的。反應(yīng)在輕輕攪拌下在室溫下 放置90分鐘。過量的PEG被去除，并且反應(yīng)通過以HOOOg離心5分鐘通過50kDa MffCO旋 轉(zhuǎn)過濾器（EMD Millipore)來淬滅。保留物用IOmM NaH2PO4PH 8.0再洗滌兩次。綴合使用 芥子酸基質(zhì)通過MALDI-T0F來驗證。單PEG化的級分通過HPLC(1200系列，Agilent，使用 串聯(lián)的兩個TOSOH TSK凝膠G3000SWxl柱子）來分離，并使用芥子酸基質(zhì)通過MALDI-T0F 來驗證。
[0215] Tf-DAK-PEG-Au 納米顆粒的制備：Tf-DAK-PEG-OPSS 或 Tf-PEG-OPSS 以 120x 摩爾 過量添加至具有50nm直徑的金納米顆粒（BBI international)的。溶液被強烈攪拌90 分鐘。mPEG-SH(5kDa，Laysan Bio)以10, OOOx過量來添加并攪拌60分鐘。顆粒通過以 20, OOOg離心10分鐘來收集，并用dH20洗滌和短暫聲處理。該過程再重復(fù)兩次以給予總計 三次洗滌。在最終離心之后，將顆粒重懸于IOmM NaH2PO4PH 8. O中。為了制備非靶向的顆 粒（Au-PEG)，僅mPEG-SH被添加至50mM金核心，伴隨強烈攪拌60分鐘。顆粒如以上描述來 純化。
[0216] 納米顆粒表征：將納米顆粒在PBS中稀釋，并且流體動力學直徑使用動態(tài)光散射 (DLS)和納米追蹤分析（NTA)來測量。顆粒濃度（顆粒/mL)還使用相同樣品中三次測量的 平均值通過NTA來確定。ζ電勢使用0. 02的靶剩余在I. 5mM KCl (pH7. 0)通過DLS來測 量。
[0217] 納米顆粒對K562細胞的結(jié)合親和力：K562細胞在37°C，5% 0)2下，在具有青霉素 /鏈霉素的DMEM+10%FBS中生長。細胞用PBS來洗滌，并使用細胞刮取出。在300g離心3 分鐘之后，細胞在4°C下使用BD Cytofix(BD Biosciences)固定20分鐘。細胞在PBS+4% BSA中清洗和重懸。將包含120個Tf/顆粒的Tf-DAK-PEG-Au NP在37°C下在IOOmM NaOAC pH 5. 5或IOOmM NaHCO3PH 8. 5中孵育一小時。顆粒通過以20, OOOg離心10分鐘來收集， 并重懸于PBS+4% BSA中。將漸增濃度的納米顆粒添加至以5e6個細胞/mL的le6個細胞， 并在RT下靜置90分鐘。細胞以300g離心3分鐘，并用15mL PBS洗滌兩次。最后，細胞用 銀增強溶液（Ted Pella)進行染色，顯影15分鐘，并且焚光使用酶標儀（Tecan, infinite M900)來讀取（310nm激發(fā)、400nm發(fā)射）。使用Matlab中的nlinfit將數(shù)據(jù)擬合至Langmuir 結(jié)合等溫線并計算Kd。
[0218] 納米顆?？缭絙End. 3細胞的轉(zhuǎn)胞吞作用：bEnd. 3細胞在37°C，5% 0)2下，在具 有青霉素/鏈霉素的DMEM+10% FBS中生長。細胞以82, 500個細胞/孔接種在12mm涂覆 PET的Traaswell?支持物（Corning)上。每三天替換頂部孔和底部孔中的培養(yǎng)基?？缟?皮電阻（TEER)在 Endohm 室中并使用 EVOM 電阻計（World Precision Instruments)來測 量。在TEER達到彡300hmS*cm2之后，進行轉(zhuǎn)胞吞試驗。將可裂解的，非可裂解的以及非靶 向的顆粒以IelO個顆粒/孔添加至頂部孔中。在多種時間點，從底部孔中取出50uL并用 新鮮培養(yǎng)基替換。該等分試樣使用PBS稀釋至250uL，并且納米顆粒濃度使用NTA進行測 量。頂部孔中的總納米顆粒的運行計數(shù)被計算并用來確定轉(zhuǎn)胞吞作用的能力（圖15)。
[0219] Tf-DAK-PEG-Au納米顆粒注入BALB/c小鼠。所有動物根據(jù)由加州理工學院動物 護理與使用委員會（Caltech Institutional Animal Care and Use Committee)批準的 用于動物護理與使用的NIH指導(dǎo)方針來處理。每顆粒包含120個Tf-DAK-PEG分子的總計 4. 5χ10η個金納米顆粒如先前描述來制備。在純化之后，將顆粒懸于150uL PBS pH7. 4中， 并注入雌性BALB/c小鼠 （Jackson laboratory)的側(cè)尾靜脈中。小鼠在注射十二個小時之 后通過CO2室息被安樂死。將大腦立即取出并置于10%中性緩沖的福爾馬林中，并在4°C 儲存過夜。大腦然后在漸增濃度的乙醇中（3x 30分鐘每次）脫水，在二甲苯中平衡（3x 30 分鐘洗滌）以及在50%二甲苯/50%熔融石蠟中平衡（30分鐘）。將組織置于純?nèi)廴谑?中（3x 1小時），置于石蠟?zāi)＞?，讓其冷卻，并獲得5um切片。切片用二甲苯脫蠟，用連續(xù)稀 釋的乙醇再水化。納米顆粒通過根據(jù)制造商的指導(dǎo)手冊用銀增強溶液（Ted Pella)染色來 可視化。組織用漸增量的乙醇和二甲苯脫水，并用Permount(Fisher)進行固定。所有光學 顯微術(shù)圖像使用OCapture Pro成像軟件（QImaging)在具有40x物鏡的Olympus 1X50顯 微鏡上采集。
【主權(quán)項】
1. 一種將納米顆粒遞送至受試者腦部的方法，所述方法包括向所述受試者施用具有納 米顆粒核屯、和祀向劑的納米顆粒，其中所述祀向劑包含對由腦內(nèi)皮細胞表達的受體特異性 的配體和將所述配體連接至所述納米顆粒核屯、的銜接物，其中所述銜接物當在腦內(nèi)皮細胞 內(nèi)部時導(dǎo)致所述配體從所述納米顆粒解離，并且其中所述配體通過所述銜接物被綴合至所 述納米顆粒核屯、的外表面。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中： 所述納米顆粒核屯、的表面包含W下的任一個：陽離子粘液酸聚合物（cMAP)、聚乳 酸-徑基乙酸共聚物（PLGA)、殼聚糖、合成的聚合物諸如聚乙締亞胺、樹狀聚體、金或氧化 鐵； 所述配體是W下的任一個：轉(zhuǎn)鐵蛋白、對轉(zhuǎn)鐵蛋白受體特異性的抗體、特異性結(jié)合至 轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的多膚、膜島素、對膜島素受體特異性的抗體、特異性結(jié)合至膜島素受體的多 膚、膜島素樣生長因子1、對膜島素樣生長因子受體1特異性的抗體、特異性結(jié)合至膜島素 樣生長因子受體1的多膚、載脂蛋白E、血管膚素-2(angiopep-2)、對低密度脂蛋白受體或 脂蛋白受體相關(guān)蛋白特異性的抗體、特異性結(jié)合至低密度脂蛋白受體或脂蛋白受體相關(guān)蛋 白的多膚；對白喉毒素受體特異性的抗體、或特異性結(jié)合至白喉毒素受體的多膚；并且 所述銜接物當未結(jié)合至所述納米顆粒時包含硝基苯棚酸，并且當結(jié)合至所述納米顆粒 時形成硝基苯棚酸醋。3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述納米顆粒核屯、包含具有W下結(jié)構(gòu)的陽離子粘液 酸聚合物（CMAP):其中m是5和50之間的任何整數(shù)。4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其中m是6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16中的任一 個。5. 如任一項前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述祀向劑的銜接物還包含在所述硝基苯 棚酸和所述配體之間的聚乙二醇（PEG)聚合物。6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述銜接物具有W下結(jié)構(gòu)：其中n是2和2000之間的任何整數(shù)，且R是選自W下的官能團：伯胺、疊氮、醇、琉基、 醒或簇酸。7. 如任一項前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述祀向劑是且n是2和2000之間的任何整數(shù)。8. 如權(quán)利要求6或7所述的方法，其中n是從約110至約150的任何整數(shù)。9. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中： 所述納米顆粒核屯、的表面包含聚乳酸-徑基乙酸共聚物（PLGA)聚合物， 所述配體是W下的任一個：轉(zhuǎn)鐵蛋白、對轉(zhuǎn)鐵蛋白受體特異性的抗體、特異性結(jié)合至 轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的多膚、膜島素、對膜島素受體特異性的抗體、特異性結(jié)合至膜島素受體的多 膚、膜島素樣生長因子1、對膜島素樣生長因子受體1特異性的抗體、特異性結(jié)合至膜島素 樣生長因子受體1的多膚、載脂蛋白E、血管膚素-2、對低密度脂蛋白受體或脂蛋白受體相 關(guān)蛋白特異性的抗體、特異性結(jié)合至低密度脂蛋白受體或脂蛋白受體相關(guān)蛋白的多膚；對 白喉毒素受體特異性的抗體、或特異性結(jié)合至白喉毒素受體的多膚；并且 所述銜接物包含PEG聚合物。10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述PEG聚合物經(jīng)由二硫鍵或具有酶裂解位點的多 膚被綴合至所述配體。11. 如權(quán)利要求9或10所述的方法，其中所述納米顆粒核屯、包含具有W下結(jié)構(gòu)的 PLGA：其中，X和y獨立地是5和500之間的任何整數(shù)。12. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中X和y獨立地是40、45、50、55或60中的任一個。13. 如權(quán)利要求11或12所述的方法，其中包含PLGA的所述納米顆粒核屯、被綴合至PEG 銜接物，并具有W下結(jié)構(gòu)：且Z是2和2000之間的任何整數(shù)，且X和y獨立地是5和500之間的任何整數(shù)，且R 選自伯胺、疊氮、醇、琉基、醒或簇酸。14. 如權(quán)利要求13所述的方法，其中Z是從約110至約150之間的任何整數(shù)，且X和y 是50。15. 如權(quán)利要求9至14的任一項所述的方法，其中所述祀向劑是：且Z是從約110至約150的任何整數(shù)，且X和y是50。16. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中： 所述納米顆粒核屯、的表面包含W下的任何一個：陽離子粘液酸聚合物（cMAP)、聚乳 酸-徑基乙酸共聚物（PLGA)、殼聚糖、合成的聚合物諸如聚乙締亞胺、樹狀聚體、金或氧化 鐵； 所述配體是W下的任一個：轉(zhuǎn)鐵蛋白、對轉(zhuǎn)鐵蛋白受體特異性的抗體、特異性結(jié)合至 轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的多膚、膜島素、對膜島素受體特異性的抗體、特異性結(jié)合至膜島素受體的多 膚、膜島素樣生長因子1、對膜島素樣生長因子受體1特異性的抗體、特異性結(jié)合至膜島素 樣生長因子受體1的多膚、載脂蛋白E、血管膚素-2、對低密度脂蛋白受體或脂蛋白受體相 關(guān)蛋白特異性的抗體、特異性結(jié)合至低密度脂蛋白受體或脂蛋白受體相關(guān)蛋白的多膚；對 白喉毒素受體特異性的抗體、或特異性結(jié)合至白喉毒素受體的多膚；并且 所述銜接物包含綴合至PEG的二氨基縮酬。17. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述銜接物包含當所述納米顆粒在腦內(nèi)皮細胞內(nèi) 部時能夠被還原導(dǎo)致所述配體從所述納米顆粒解離的二硫鍵。18. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述銜接物包含當所述納米顆粒在腦內(nèi)皮細胞內(nèi) 部時能夠被酶促裂解導(dǎo)致所述配體從所述納米顆粒解離的多膚或化學鍵。19. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述銜接物包含當所述納米顆粒在腦內(nèi)皮細胞內(nèi) 部時能夠在低抑下被破壞導(dǎo)致所述配體從所述納米顆粒解離的可水解的化學鍵。20. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述銜接物包含具有W下地a的化學鍵，當納米顆 粒在腦內(nèi)皮細胞之內(nèi)時，所述化學鍵能夠在低抑下被破壞導(dǎo)致配體從納米顆粒解離。21. 如權(quán)利要求19或20所述的方法，其中低抑是從約6.8至約2.0之間的值。22. 如權(quán)利要求21所述的方法，其中低抑是從約5. 5至約2. 5之間的值。23. 如權(quán)利要求21所述的方法，其中低抑是從約5. 5至約4. 0之間的值。24. 如權(quán)利要求17至23中的任一項所述的方法，其中所述納米顆粒核屯、的表面包含聚 乳酸-徑基乙酸共聚物（PLGA)。25. 如權(quán)利要求17至23中的任一項所述的方法，其中所述納米顆粒核屯、的表面包含陽 離子粘液酸聚合物（CMAP)。26. 如權(quán)利要求17至23中的任一項所述的方法，其中所述納米顆粒核屯、的表面包含 金O27. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中： 所述納米顆粒核屯、的表面包含所述納米顆粒核屯、的表面包含W下的任一個：陽離子粘 液酸聚合物（cMAP)、聚乳酸-徑基乙酸共聚物（PLGA)、殼聚糖、合成聚合物諸如聚乙締亞 胺、樹狀聚體、金或氧化鐵； 所述配體為W下的任一個：轉(zhuǎn)鐵蛋白、對轉(zhuǎn)鐵蛋白受體特異性的抗體、特異性結(jié)合至 轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的多膚、膜島素、對膜島素受體特異性的抗體、特異性結(jié)合至膜島素受體的多 膚、膜島素樣生長因子1、對膜島素樣生長因子受體1特異性的抗體、特異性結(jié)合至膜島素 樣生長因子受體1的多膚、載脂蛋白E、血管膚素-2、對低密度脂蛋白受體或脂蛋白受體相 關(guān)蛋白特異性的抗體、特異性結(jié)合至低密度脂蛋白受體或脂蛋白受體相關(guān)蛋白的多膚；對 白喉毒素受體特異性的抗體、或特異性結(jié)合至白喉毒素受體的多膚；并且 所述銜接物包括選自W下的可酸裂解的化學鍵：綴合至PEG的原酸醋、縮醒、縮酬、亞 胺或腺。28. 如任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述納米顆粒包含少于200個綴合至其表 面的祀向劑。29. 如任一項前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述納米顆粒包含少于20個綴合至其表 面的祀向劑。30. 如任一項前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述納米顆粒包含少于5個綴合至其表 面的祀向劑。31. 如任一項前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述納米顆粒包含單個綴合至其表面的 祀向劑。32. 如任一項前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述納米顆粒具有通過動態(tài)光散射 值L巧測量的從約40皿至約100皿的尺寸。33. 如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述納米顆粒具有通過動態(tài)光散射值L巧測量的 從約50皿至約70皿的尺寸。34. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述納米顆粒具有通過動態(tài)光散射值L巧測量的 55nm、56nm、57nm、58nm、59nm、60nm、6Inm、62nm、63nm、64nm、65nm、66nm、67nm、68nm或 69nm 的尺寸。35. 如任一項前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述納米顆粒具有通過相位分析光散射 測量的從約-0. 5mV至約-15.OmV的平均C電勢。36. 如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述納米顆粒具有通過相位分析光散射測量的-5 ,0、-5.1、-5.2、-5.3、-5.4、-5.5、-5.6、-5.7、-5.8、-5.9、-6.0、-6.1、-6.2、-6.3、-6.4、-6.5、-6.6、- 6. 7、-6.8、-6. 9、-7. 0、-7. 1、-7. 2、-7. 3、-7. 4、-7. 5、-7. 6、-7. 7、-7. 8、-7. 9 或-8.OmV的平 均C電勢。37. 如任一項前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述納米顆粒還包含治療劑。38. 如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述治療劑針對神經(jīng)素亂有效。39. 如權(quán)利要求37或38所述的方法，其中所述治療劑是5-徑色胺或多己胺。40. 如任一項前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述納米顆粒還包含顯像劑。41. 如權(quán)利要求40所述的方法，其中所述顯像劑是化-64。42. 如任一項前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述納米顆粒包含第一祀向劑和第二祀 向劑，其中所述第二祀向劑包含： 銜接物，當在腦內(nèi)皮細胞內(nèi)部時，所述銜接物并不易于從所述納米顆粒核屯、解離，W及 配體，所述配體將所述顆粒祀向至腦中的特定細胞。43. -種用于產(chǎn)生祀向遞送至腦部的納米顆粒的試劑盒，所述試劑盒包含陽離子粘液 酸聚合物（cMAP);對由腦內(nèi)皮細胞表達的受體特異性的祀向劑，其中所述祀向劑包含被綴 合至銜接物的配體，所述銜接物當在腦內(nèi)皮細胞內(nèi)部時導(dǎo)致所述配體從所述納米顆粒解 離；W及用于組裝所述納米顆粒的說明書。44. 一種用于產(chǎn)生祀向遞送至腦部的納米顆粒的試劑盒，所述試劑盒包含聚乳酸-徑 基乙酸共聚物（PLGA);對由腦內(nèi)皮細胞表達的受體特異性的祀向劑，其中所述祀向劑包含 被綴合至銜接物的配體，所述銜接物當在腦內(nèi)皮細胞內(nèi)部時導(dǎo)致所述配體從所述納米顆粒 解離；W及用于組裝所述納米顆粒的說明書。45. 如權(quán)利要求43或44所述的試劑盒，其中所述配體是W下的任一個：轉(zhuǎn)鐵蛋白、對 轉(zhuǎn)鐵蛋白受體特異性的抗體、特異性結(jié)合至轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的多膚、膜島素、對膜島素受體特 異性的抗體、特異性結(jié)合至膜島素受體的多膚、膜島素樣生長因子1、對膜島素樣生長因子 受體1特異性的抗體、特異性結(jié)合至膜島素樣生長因子受體1的多膚、載脂蛋白E、血管膚 素-2、對低密度脂蛋白受體或脂蛋白受體相關(guān)蛋白特異性的抗體、特異性結(jié)合至低密度脂 蛋白受體或脂蛋白受體相關(guān)蛋白的多膚；對白喉毒素受體特異性的抗體、或特異性結(jié)合至 白喉毒素受體的多膚；并且其中所述銜接物當未結(jié)合至所述納米顆粒時包含硝基苯棚酸， 而當結(jié)合至所述納米顆粒時形成硝基苯棚酸醋。46. 如權(quán)利要求43至45的任一項所述的試劑盒，所述試劑盒還包含治療劑或顯像劑。
【專利摘要】本文描述了通過向受試者施用具有納米顆粒核心和靶向劑的納米顆粒將納米顆粒遞送至受試者腦部的方法。多種靶向劑可用來促進所述的納米顆粒的遞送。例如，靶向劑可包含特異于對由腦內(nèi)皮細胞表達的受體特異性的配體和將配體連接至納米顆粒核心外表面的銜接物。另外，當在細胞內(nèi)部時，銜接物可促進配體從納米顆粒解離。
【IPC分類】A61K31/56, C08G63/06, A61K8/02
【公開號】CN105377942
【申請?zhí)枴緾N201480040041
【發(fā)明人】馬克·E·戴維斯, 戴文·威利, 安德魯·克拉克
【申請人】加州理工學院
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2014年5月14日
【公告號】CA2911344A1, EP2997070A1, US20140348754, WO2014185964A1