用于改善的病毒生產的禽類細胞的制作方法
【專利說明】用于改善的病毒生產的禽類細胞發(fā)明領域
[0001]本發(fā)明涉及一種禽類細胞，其中至少一種干擾素誘導型跨膜蛋白(IFITM)的表達和/或活性減少。
[0002]發(fā)明背景
[0003]對病毒性感染和疾病的預防和控制代表了對于醫(yī)學和獸醫(yī)學的一項持續(xù)挑戰(zhàn)。因此，減少病毒性疾病的發(fā)病率和嚴重性的方法保持在醫(yī)學和生物學技術研究的前沿。
[0004]目前用于控制病毒性感染和疾病的最常見的策略是疫苗接種的方法。疫苗可以包含滅活的病毒或其純化的產物，其已經使用化學物例如氮雜環(huán)丙烷(aziridine)處理，例如二乙稀亞胺(binary ethyleneimine, ΒΕΙ)?；蛘?，疫苗可以包含活的、減毒的病毒，其已經在導致毒力喪失而保持免疫原性的條件下培養(yǎng)。例如，致病性病毒可以通過一系列細胞培養(yǎng)物或動物胚胎傳代，直到它在其靶細胞中在復制方面足夠差，使得其可以用作疫苗的點。在這點時，病毒已經喪失了毒力但仍然具有免疫原性并能夠刺激免疫反應。
[0005]胚胎雞蛋和原代雞胚胎成纖維細胞(CEF)通常用于制造人用和獸用病毒疫苗，包括傳統(tǒng)的大體積疫苗例如流感或新城疫(Newcastle Disease)疫苗以及更現代的用于疫苗的重組病毒載體(例如痘病毒)。為了生成無毒力的減毒病毒，胚胎雞蛋和CEF用于傳代病毒。利用減毒病毒的疫苗的例子包括麻疹疫苗，腮腺炎疫苗，風疹疫苗，口服脊髓灰質炎疫苗(Sabin)和黃熱病疫苗。
[0006]病毒性疾病對動物和人類健康兩者的全球負擔導致要求大規(guī)模生產疫苗中使用的滅活的和減毒的病毒。另外，季節(jié)性流行病的爆發(fā)，例如流感的爆發(fā)，要求在短時期內生產大量的病毒。實際上，流行病期間治療有效的流感病毒疫苗的全球可用性仍然是對于生物醫(yī)藥工業(yè)的重大挑戰(zhàn)。
[0007]影響胚胎雞蛋和CEF在生產用于疫苗的病毒中的使用的一個當前問題是生成所需的大量病毒所花費的時間。另外，在疫苗中使用活的，減毒的病毒的一個缺點是為了生成減毒的病毒，在宿主細胞中達到足夠數量的傳代所花費的時間長度。例如，高度減毒的修飾疫苗病毒Ankara (MVA)，其充當候選疫苗以針對感染性疾病和癌癥免疫，要求在CEF中多于500次傳代以生成減毒的MVA，其喪失了編碼基因組序列的重要部分，并對哺乳動物細胞表現出對復制的嚴重限制。另外，對宿主細胞中病毒傳代速率的限制可能作為限制步驟，從而影響病毒生產和產出(yield)。
[0008]因此，需要在用于生產疫苗的系統(tǒng)(例如胚胎雞蛋和CEF中)中增加滅活的和減毒的病毒兩者的產出和生產效率的方法。
[0009]附圖簡述
[0010]圖1:chIFITM基因座結構和多序列比對
[0011 ] Gga5上的IFITM基因簇側翼有ATHL1和BAGALNT4。這一區(qū)域與Hsl 1上的IFITM 基因簇同線(syntenic) (A)。使用 ClustalW 和手動比對細化(manual alignmentrefinement)進行了人，黑猩猩和雞直系同系物(ortholgoue)比對，并使用B1Edit注釋。彩色柱示出了所有的9種IFITM序列之間共享的殘基。使用序列下方的符號突出顯示了重要的殘基:A -酪氨酸；0-雙半胱氨酸；*_對于多聚化重要的苯丙氨酸；丨-保守的泛素化賴氨酸。頂1(膜內1)，CIL(保守的胞內環(huán))，頂2(膜內2)。
[0012]圖2:使用一系列假型化(pseudotyped)病毒感染A549細胞，所述假型病毒具有狂犬病病毒糖蛋白包膜(CVS ;攻擊病毒標準品(狂犬病病毒)，MHK ;莫科拉(Mokola)病毒和RV1，拉哥斯蝙蝠(Lagos bat)病毒)或流感血凝素包膜(H1 (人)，H4 (禽)和H5 (人)，H7(禽)，H10(禽))。
[0013]圖3:過表達的IFITM蛋白在A549細胞中的細胞定位。
[0014]圖4: (A) IFN- γ刺激后，DF-1雞細胞中chIFITM3表達的對數倍數變化(log foldchange)，(B)使用 chIFITM3 特異性 siRNA (CH)或雜亂(scrambled) si RNA (NS)的 chIFITM3敲低百分比，(C)使用甲型流感病毒(A/WSN/1933(WSN/33))對DF-1細胞的感染，使用針對核蛋白(NP)的抗體通過流式細胞術測量。在所有情況下，使用與chlFITM特異性siRNA(CH)或雜亂siRNA(NS)的預孵育。誤差棒表示以一式三份進行的每種條件間的標準偏差。
[0015]圖5:雞IFITM轉錄物在一組組織中的差異表達。
[0016]圖6:根據表達的蛋白水平(A)，根據HA標簽的蛋白印跡⑶表達不同水平chIFTIM3蛋白的A549細胞限制用拉哥斯蝙蝠病毒(LBV)糖蛋白包膜假型化的慢病毒的復制。
[0017]圖7:雞IFITM3在DF-1雞細胞中具有抗病毒活性。使用TNF-α和TNF-γ刺激后，或與非靶向siRNA或一種chIFITM3特異性siRNA預孵育后，使用定量RT-PCR測量chIFITM3的表達水平或對數倍數變化(A)。通過流式細胞術使用針對核蛋白(NP)的抗體測量了使用甲型流感病毒(A/WSN/1993[WSN/33])感染的DF01細胞中敲低內源性chIFITM3表達的影響(B)。P = 0.01，學生t檢驗。通過WSN感染使用chIFITM3轉染的DF-1細胞。通過流式細胞術檢測了 HA和NP的表達(C和D)，并通過PFU測量了病毒滴度(E)。誤差棒表示以一式三份進行的每種條件間的標準偏差。
[0018]發(fā)明概述
[0019]干擾素誘導型跨膜(IFITM)蛋白家族是干擾素刺激的基因家族，其限制幾種高度病原性人類病毒的復制，包括SARS冠狀病毒，絲狀病毒(馬爾堡病毒和埃博拉病毒)，甲型流感病毒和黃病毒(登革病毒)。雖然IFITM基因座(其包括IFITM1，2，3和5)存在于哺乳動物物種中，但是該基因座在禽類物種中尚未得到鑒定和表征。本發(fā)明者證明了 IFITM基因座存在于雞中并鑒定了新的禽類IFITM序列，其在細胞中表達時與抑制細胞的病毒性感染的能力相關。
[0020]這些鑒定的IFITM序列可以促進在禽類宿主細胞中傳代和繁殖病毒的改進的方法。它們也可以用于對禽類動物篩選對病毒性感染的抗性以及在群體中選擇具有增加的對病毒性感染的抗性的動物的方法。
[0021]因此，在第一個方面，本發(fā)明提供禽類細胞，其具有一種或多種以下多肽或其同系物的降低的表達和/或活性:雞IFITM1(SEQ ID N0.1) J|IFITM2(SEQ ID N0.2)和雞IFITM3(SEQ ID N0.3)。
[0022]所述細胞可以具有降低的雞IFITM3(SEQ ID N0.3)或其同系物表達。
[0023]所述禽類細胞可以在禽類胚胎中。所述禽類細胞可以來源于禽類胚胎。例如，所述禽類細胞可以是雞胚胎成纖維細胞(CEF)。
[0024]所述細胞可以是器官，卵/蛋，禽或任意其它動物的一部分。
[0025]所述禽類細胞可以包含一種或多種以下多肽，或其同系物的突變形式:雞IFITM1 (SEQ ID N0.1) J|IFITM2(SEQ ID N0.2)和雞 IFITM3(SEQ ID N0.3)，其中所述突變形式與對病毒感染的減少的抗性相關。
[0026]所述禽類細胞的基因組可以缺少一種或多種編碼以下多肽或其同系物之一的核苷酸序列:雞 IFITM1(SEQ ID N0.1) J|IFITM2(SEQ ID N0.2)和雞 IFITM3 (SEQ ID N0.3)。
[0027]或者，在所述禽類細胞中通過RNA干擾(RNAi)可以降低以下一種或多種多肽，或其同系物的表達:雞 IFITM1 (SEQ ID N0.1);雞 IFITM2 (SEQ ID N0.2)和雞 IFITM3 (SEQ IDN0.3)o
[0028]在第二個方面，本發(fā)明涉及用于繁殖(propagate)病毒的方法，其包括以下步驟:
[0029](i)使用病毒轉導根據本發(fā)明的第一個方面的禽類細胞；和
[0030](ii)傳代所述細胞以繁殖所述病毒。
[0031]在第三個方面，本發(fā)明提供用于生產疫苗的方法，其包括以下步驟:
[0032](i)根據本發(fā)明的第二個方面的方法繁殖病毒；和，
[0033](ii)將所述繁殖的病毒摻入疫苗中。
[0034]在第四個方面，本發(fā)明提供用于生成減毒的病毒的方法，其包括以下步驟:
[0035]⑴使用病毒轉導根據本發(fā)明的第一個方面的禽類細胞；和，
[0036](ii)傳代所述禽類細胞，使得所述病毒完成多輪感染并變得減毒。
[0037]在第五個方面，本發(fā)明提供用于生產疫苗的方法，其包括以下步驟:
[0038](i)根據本發(fā)明的第四個方面使病毒減毒；
[0039](ii)繁殖所述減毒的病毒；和
[0040](iii)將(ii)中生成的病毒摻入疫苗中。
[0041]在本發(fā)明的第五個方面的方法中，可以根據本發(fā)明的第二個方面的方法進行步驟
(ii)。
[0042]根據第二至第五方面任一項的方法，所述病毒可以經由酸性內體進入。
[0043]在第六個方面，本發(fā)明提供轉基因禽類動物，其中一種或多種以下多肽，或其同系物的表達或活性被降低，敲低或敲除:雞IFITM1(SEQ ID N0.1) J|IFITM2(SEQ ID N0.2)和雞 IFITM3 (SEQ ID N0.3)。
[0044]在第七個方面，本發(fā)明提供轉基因禽類動物，其生殖細胞和體細胞包括編碼以下一種或多種多肽或其同系物的一種或多種核苷酸序列的異質形式(heterogenicvers1n):雞 IFITM1(SEQ ID N0.1) J|IFITM2(SEQ ID N0.2)和雞 IFITM3 (SEQ ID N0.3),該基因在胚胎階段時引入到所述動物中，或所述動物的祖先中。
[0045]在第八個方面，本發(fā)明提供轉基因禽類動物，其中編碼以下多肽或其同系物的一種或多種基因的拷貝數增加:雞IFITM1(SEQ ID N0.1);雞IFITM2 (SEQ ID N0.2)和雞IFITM3(SEQ ID N0.3)。
[0046]根據本發(fā)明的第六，第七或第八個方面的轉基因動物可以是家養(yǎng)家禽動物。例如，所述轉基因動物可以是雞。
[0047]在第九個方面，本發(fā)明提供根據本發(fā)明的第一個方面的禽類細胞，其來源于根據本發(fā)明的第六，第七或第八個方面的轉基因禽類動物。
[0048]在第十個方面，本發(fā)明涉及用于調查禽類動物對病毒性感染的先天性抗性的方法，其包括下述步驟:調查編碼一種或多種以下多肽或其同系物的核苷酸序列??雞IFITM1 (SEQ ID N0.1) J|IFITM2(SEQ ID N0.2)和雞 IFITM3(SEQ ID N0.3)和 / 或調查所述核苷酸序列在基因組上的拷貝數。
[0049]在第^^一個方面，本發(fā)明提供用于從同一物種的多個禽類動物中選擇對病毒性感染具有抗性的禽類動物的方法，其包括以下步驟:
[0050](i)在所述多個禽類動物中調查編碼以下一種或多種多肽，或其同系物的核苷酸序列??雞 IFITM1 (SEQ ID N0.1);雞 IFITM2 (SEQ ID N0.2)和雞 IFITM3 (SEQ ID N0.3)和 /或所述核苷酸序列在基因組上的拷貝數。
[0051](ii)選擇具有與對病毒性感染的抗性相關的IFITM1，IFITM2和/或IFITM3核苷酸序列和/或拷貝數的禽類動物。
[0052]多個禽類動物在IFITM基因座處可能表現出遺傳變異和/或拷貝數變異。
[0053]病毒感染可以由經由酸性內體進入的病毒介導。例如，病毒感染可以由禽流感病毒(AIV)，感染性支