發(fā)酵方法
【專利說明】發(fā)酵方法 發(fā)明領域
[0001] 本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)二羧酸的方法。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 二羧酸（例如蘋果酸、富馬酸和琥珀酸）是重要的化合物，其在食品工業(yè)中用于食 物制備和保存，在醫(yī)藥工業(yè)中用于配制醫(yī)藥制品，以及用于（生物）聚合物中的構建單元和 其他工業(yè)用途。為了滿足對二羧酸的日益增加的需要，正在開發(fā)更高效和更具成本效益的 生產(chǎn)方法。
[0004] 已知一些生產(chǎn)二羧酸的方法。傳統(tǒng)上，通過在中性pH下發(fā)酵細菌來制造二羧酸， 這例如描述于US 5, 573, 931中。另外，其它微生物如酵母已被用于在低pH下生產(chǎn)二羧酸， 其優(yōu)點為直接生產(chǎn)酸（W02010/003728)。
[0005] 為了實現(xiàn)經(jīng)濟上可行的方法，需要快速高效地生產(chǎn)二羧酸。所需效率設置了發(fā)酵 方法中可使用的生物質(zhì)的量的上限。這影響了生產(chǎn)力，其正是目前的方法所遭遇的問題。這 可通過重復利用生物質(zhì)從而允許較高的生物質(zhì)濃度來解決。這種提高發(fā)酵速率的技術在許 多應用如乙醇生產(chǎn)（Cyzewski等人，1977)中被充分描述。
[0006] 然而，對于二羧酸的生產(chǎn)，在第二發(fā)酵運行中觀察到了對固有活性的負面影響。這 意味著：大部分重復利用的生物質(zhì)不再生產(chǎn)，從而阻礙整合了細胞再循環(huán)的方法的實施。
[0007] 本公開旨在提供經(jīng)改進的發(fā)酵生產(chǎn)二羧酸的方法，當用于上述發(fā)酵中時，所述方 法克服了不產(chǎn)出性（non-productive)生物質(zhì)的缺點。
[0008] 發(fā)明簡沐
[0009] 本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)二羧酸的方法。所述方法包括在容器（vessel)中發(fā)酵真菌 菌株，所述容器包含合適的發(fā)酵培養(yǎng)基。進行所述方法的方式使得至少部分細胞被重復利 用（即，再循環(huán)）。細胞可被再循環(huán)回原始容器或者再循環(huán)入第二容器。關鍵地，部分真菌 細胞的重復利用在維生素和/或微量元素的存在下進行。
[0010] 在經(jīng)由真菌菌株發(fā)酵的標準二羧酸生產(chǎn)期間，通常會看到比生產(chǎn)力（QP)的降低。 類似地，在相同培養(yǎng)基中生長的再循環(huán)細胞也展示出比生產(chǎn)力（QP)的降低。然而，出乎意 料地，我們已發(fā)現(xiàn)：當進行重復利用時向培養(yǎng)基補充維生素和微量元素導致QP被完全恢 復，達到了與初始發(fā)酵中相同的水平。可觀察到較高的KPi :qp降低和較高Yps。
[0011] 因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了用于制備二羧酸的方法，所述方法包括在包含合適發(fā)酵 培養(yǎng)基的容器中發(fā)酵真菌細胞，其中在維生素和/或微量元素的存在下重復利用至少部分 真菌細胞。 附圖簡介
[0012] 圖1顯示了不同細胞再循環(huán)之前和之后的琥珀酸生產(chǎn)力（按照生物質(zhì)歸一化）。
[0013] 圖2顯示了具有不同起始生物質(zhì)濃度的再循環(huán)培養(yǎng)中琥珀酸濃度的演變。
[0014] 圖3顯示了培養(yǎng)基組成對再循環(huán)培養(yǎng)的影響的表征。生產(chǎn)培養(yǎng)被用作參照。A.所 產(chǎn)生琥珀酸的量；B.達到的KPI。
[0015] 圖4顯示了各發(fā)酵的KPI值及其累計值（即，考慮到之前運行的發(fā)酵）的比較。
[0016] 發(fā)明詳沐
[0017] 在本說明書和附屬權利要求的通篇，詞語"包括"、"包含"和"具有"應被解釋為包 含性的。換言之，在語境允許的情況下，這些詞語意圖傳達的意思是：可以包括其它沒有明 確列舉的要素或整體。
[0018] 本文中不使用數(shù)量詞修飾時指的是一個/種或多于一個/種（即一個/種或至少 一個/種）語法對象。例如，"要素"可意味著一個/種要素或多于一個/種要素。
[0019] 本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)二羧酸的方法。術語"二羧酸"和"二羧酸根 (dicarboxylate) "（例如"琥珀酸或蘋果酸"和"琥珀酸根和蘋果酸根"）在本文中具有相 同含義并可交換使用，前者是后者的氫化形式。
[0020] 在所述方法中，在包含合適發(fā)酵培養(yǎng)基的容器中發(fā)酵真菌細胞。本文所使用的術 語發(fā)酵指的是化合物的微生物生產(chǎn)，在此處是由碳水化合物生產(chǎn)二羧酸。
[0021] 優(yōu)選地，發(fā)酵產(chǎn)物是二羧酸，優(yōu)選地蘋果酸、富馬酸或琥珀酸或己二酸，優(yōu)選地琥 珀酸。
[0022] 用于生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品的方法的一些優(yōu)選實施方式在本文中被進一步限定為用于生 產(chǎn)二羧酸的方法。
[0023] 關鍵地，在本發(fā)明中，在維生素和/或微量元素的存在下，發(fā)酵中使用的至少部分 真菌細胞被重復利用，即一部分真菌細胞被再循環(huán)。
[0024] 本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)二羧酸的方法。所述方法包括在容器中發(fā)酵真菌菌株， 所述容器包含合適的發(fā)酵培養(yǎng)基。進行所述方法的方式使得至少部分細胞被重復利用。細 胞可被再循環(huán)回原始容器或者再循環(huán)入第二容器。關鍵地，真菌細胞的重復利用在維生素 和/或微量元素的存在下進行。
[0025] 為了本發(fā)明目的，維生素是生物體（在這種情況下是真菌菌株）以有限的量需要 的作為重要營養(yǎng)物的有機化合物。當有機化學化合物（或相關的化合物組）不能被生物體 (真菌菌株）足量合成時，其可被視為維生素。
[0026] 用于本發(fā)明中的維生素通常是維生素B(或者形成維生素B復合物或維生素 等）。適用于本發(fā)明中的維生素 B的實例包括維生素 B1例如硫胺素、維生素 B 2(例如核 黃素）、維生素 B3(例如煙酸或煙酰胺）、維生素 B5(例如泛酸）、維生素 B6(例如吡哆醇 (pyroxidinem)、吡哆醛或吡哆胺或鹽酸吡哆醇）、維生素 B7 (例如生物素）、維生素 B8 (例如 肌醇）、維生素 B9 (例如葉酸）、維生素 B12 (例如各種鈷胺素，例如氰鈷胺素）或維生素 Bx (例 如對氨基苯甲酸）。在根據(jù)本發(fā)明的細胞重新利用中，可使用這些維生素中的任一種或其混 合物。
[0027] 本發(fā)明中使用的維生素的平均濃度通常低于百萬分之1000(以原子計數(shù)測量）或 者低于1000 μ g/g。本發(fā)明中使用的維生素的平均濃度通常為至少約百萬分之1 (以原子計 數(shù)測量）或者至少約1 μ g/g。
[0028] 為了本發(fā)明目的，微量元素是生物體（在這種情況下是真菌菌株）的恰當生長、發(fā) 育和生理僅以極少量需要的礦物質(zhì)。在本文中，微量元素是除了普通有機分子中存在的碳、 氫、氮和氧這四種元素之外，有生命的生物體（在這種情況下是真菌菌株）所需的化學元 素。
[0029] 通常，微量元素不是可以被視為大量營養(yǎng)素或大量礦物質(zhì)的化學元素。被視為大 量營養(yǎng)素的化學元素是生物體通常大量消耗的那些，即，碳、氫、氮、氧、磷和硫。鈣、鹽（鈉 和氯、鎂和鉀（連同磷和硫）可被添加到大量營養(yǎng)素的列表中，因為相較于其它維生素和元 素，它們被大量需要。
[0030] 因此，可被視為微量元素的元素可包括鐵、鈷、銅、鋅、鉬、碘、硒、硼、鉻、砷和硅。然 而，為了本發(fā)明的目的，大量營養(yǎng)素可被視為微量元素。在根據(jù)本發(fā)明的細胞重新利用中， 可使用任一種微量元素或任何這些微量元素的任意混合物。
[0031] 本發(fā)明中使用的微量元素的平均濃度通常低于百萬分之1000(以原子計數(shù)測量） 或者低于1000 μ g/g。本發(fā)明中使用的維生素的平均濃度通常為至少約百萬分之1 (以原子 計數(shù)測量）或者至少約1 μ g/g。
[0032] 在所述方法中，來自發(fā)酵的細胞被取出并重復利用，即，它們被再循環(huán)。這表示：它 們被重新引入同一發(fā)酵容器中和/或引入第二發(fā)酵容器（含合適的發(fā)酵培養(yǎng)基）中。然而， 在每種情況下，重復利用均在維生素和/或微量元素的存在下進行。也就是說，當真菌細胞 被重復利用時，向發(fā)酵培養(yǎng)基補充維生素和/或微量元素。
[0033] 如上所述，本發(fā)明的方法包括在維生素和/或微量元素的存在下進行的細胞重復 利用。換言之，向引入再循環(huán)細胞的發(fā)酵培養(yǎng)基中補充維生素和/或微量元素。通常，向發(fā) 酵培養(yǎng)基中補充維生素和微量元素的混合物。
[0034] 引入再循環(huán)細胞的培養(yǎng)基通常至少允許再循環(huán)細胞的一些生長。引入再循環(huán)細胞 的培養(yǎng)基可包含氮源，例如銨。還可優(yōu)選地的是加入額外的鐵源。
[0035] 可進行多個再循環(huán)/再循環(huán)步驟。例如根據(jù)本發(fā)明所述方法的生產(chǎn)二羧酸的方法 中可使用2個、3個、4個、5個或更多個再循環(huán)步驟。
[0036] 本領域技術人員可確定再循環(huán)步驟中合適的接種濃度。合適的接種濃度可以為 從約l〇g/L至約50g/L，例如約15g/L至約20g/L。合適的接種濃度可以與生產(chǎn)培養(yǎng)物 (production culture)中的最終生物質(zhì)濃度大致相同。
[0037] 根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)二羧酸的方法可以以任何合適的模式（例如，分批模式、補料 分批模式、連續(xù)模式或這些發(fā)酵模式的任意合適組合）進行。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)二 羧酸的方法以補料分批模式或連續(xù)模式進行。
[0038] 以所有這些發(fā)酵模式進行細胞再循環(huán)的方法是本領域技術人員眾所周知的。
[0039] 基于從產(chǎn)物流中分離細胞的位置，重復利用細胞的方法可彼此不同。
[0040] 這種生物質(zhì)分離可發(fā)生在發(fā)酵容器外部或內(nèi)部。如果細胞分離發(fā)生在發(fā)酵容器 外部，那么這可通過重力（例如，離心或傾析）或通過機械力（例如，過濾技術）來實現(xiàn)。 如果細胞分離發(fā)生在發(fā)酵容器內(nèi)部，那么這可通過例如以下進行：細胞沉降（settling)或 (自）凝聚，然后可除去清澈的上層并重復利用剩余細胞。
[0041] 分批發(fā)酵在本文中被定義為這樣的發(fā)酵，其中所有營養(yǎng)物在發(fā)酵開始時加入。
[0042] 補料分批發(fā)酵是這樣的分批發(fā)酵，其中營養(yǎng)物在發(fā)酵期間加入。分批和補料分批 發(fā)酵中的產(chǎn)物可在合適的時機收獲，例如在一種或更多種營養(yǎng)物耗盡時收獲。
[0043] 連續(xù)發(fā)酵是這樣的發(fā)酵，其中營養(yǎng)物被連續(xù)加入到發(fā)酵中且其中產(chǎn)物被連續(xù)地移 出發(fā)酵。
[0044] 在一個實施方式中，在本發(fā)明的方法中發(fā)酵酵母是在碳水化合物限制條件下進行 的。當在本文中使用時，碳水化合物限制條件被定義為維持碳水化合物濃度低于l〇g/l，例 如約5g/l。<