X-軸表示循環(huán)數(shù)(類(lèi)似于Ct)和y-軸表示MaxRat1。每個(gè)實(shí)驗(yàn)的每個(gè)重復(fù)單獨(dú)在圖中繪出。用100%野生型KRAS序列的實(shí)驗(yàn)用箭頭表示，和用1%突變體KRAS序列的實(shí)驗(yàn)用箭表示。
[0128]在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于G12D突變體序列的存在情況，5 ng的含有100%野生型KRAS序列的人基因組DNA的42個(gè)重復(fù)和5 ng的含有1% G12D突變體KRAS序列的人基因組DNA的6個(gè)重復(fù)通過(guò)實(shí)時(shí)PCR使用G12D特異性探針測(cè)定。在不存在UDG的情況下(圖ΙΑ ;1B)和在存在2單位的UDG的情況下(圖1C ;1D)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0129]在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于G13D突變體序列的存在情況，5 ng的含有100%野生型KRAS序列的人基因組DNA的42個(gè)重復(fù)和5 ng的含有1% G13D突變體KRAS序列的人基因組DNA的6個(gè)重復(fù)通過(guò)實(shí)時(shí)PCR使用G13D特異性探針測(cè)定。在不存在UDG的情況下(圖2A ;2B)和在存在2單位的UDG的情況下(圖2C ;2D)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0130]在第三個(gè)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于G12D突變體序列的存在情況，范圍為50 ng至400 ng的含有100%野生型KRAS序列的人基因組DNA的12個(gè)重復(fù)和范圍為50 ng至400 ng的含有1%G12D突變體KRAS序列的人基因組DNA的12個(gè)重復(fù)通過(guò)實(shí)時(shí)PCR使用G12D特異性探針測(cè)定。在不存在UDG的情況下(圖3A ；3B)和在存在2單位的UDG的情況下(圖3C ;3D)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0131]實(shí)驗(yàn)使用熱穩(wěn)定的UDG，例如來(lái)自New England B1labs的尿啼啶-DNA糖基化酶(UDG)，其是分離自Archaeglobus Λ/辦的大腸桿菌尿啼啶-DNA糖基化酶的熱穩(wěn)定的同源物。加入50%甘油的量至沒(méi)有UDG的樣品，其等同于加入至向其中加入含UDG酶的甘油的樣品中的甘油的量。熱循環(huán)條件是:1個(gè)循環(huán)的93.5°C 10分鐘；1個(gè)循環(huán)的73.5°C10分鐘；3個(gè)循環(huán)的92.0°C 15秒，73.5°C 30秒和61.0°C 60秒；接著45個(gè)循環(huán)的92°C15秒和61°C 90秒。
[0132]實(shí)驗(yàn)證實(shí)，熱穩(wěn)定的UDG (例如2單位的熱穩(wěn)定的UDG)降低假陽(yáng)性的發(fā)生率和延緩的確發(fā)生的假陽(yáng)性事件的ct。為進(jìn)一步檢驗(yàn)UDG活性，在各種條件下評(píng)價(jià)UDG以評(píng)估在存在熱穩(wěn)定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶的情況下檢測(cè)KRAS野生型和突變體序列的特異性和/或靈敏度是否改進(jìn)。
[0133]在本文提供的所述技術(shù)的實(shí)施方案的開(kāi)發(fā)期間采集的數(shù)據(jù)證實(shí)，假陽(yáng)性的發(fā)生率通過(guò)在測(cè)定樣品中包括UDG而得到極大地降低。這些數(shù)據(jù)證實(shí)，在樣品中包括熱穩(wěn)定的UDG提高測(cè)定結(jié)果。這些數(shù)據(jù)證實(shí)，消除或最小化了假陽(yáng)性；在相當(dāng)更高的Ct值下檢出假陽(yáng)性，從而提供提高的測(cè)定特異性。
[0134]上文說(shuō)明書(shū)中提及的所有出版物和專(zhuān)利通過(guò)引用以其整體結(jié)合到本文中用于所有目的。在不背離所述技術(shù)的范圍和精神的情況下，所述技術(shù)的組合物、方法和用途的各種修飾和改變對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的。盡管已結(jié)合具體的示例性的實(shí)施方案描述了所述技術(shù)，但應(yīng)理解，所要求保護(hù)的本發(fā)明不應(yīng)過(guò)度限制于這樣的具體實(shí)施方案。事實(shí)上，藥理學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)藥科學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的所述實(shí)施本發(fā)明的方式的各種修飾，意圖落入隨附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.組合物，包括包含靶序列的靶核酸、聚合酶、尿嘧啶-DNA糖基化酶和包含尿嘧啶堿基的損壞的核酸。2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述尿嘧啶-DNA糖基化酶是熱穩(wěn)定的尿嘧啶-DNA糖基化酶。3.權(quán)利要求1的組合物，其還包含對(duì)靶序列特異性的探針。4.權(quán)利要求1的組合物，其中所述聚合酶是熱活化的聚合酶。5.權(quán)利要求1的組合物，其還包括包含靶序列的擴(kuò)增子。6.權(quán)利要求1的組合物，其中所述靶序列包含單核苷酸多態(tài)性。7.權(quán)利要求1的組合物，其中所述靶序列包含胞嘧啶或鳥(niǎo)嘌呤。8.權(quán)利要求1的組合物，其包含至少0.1-1.0單位的尿嘧啶-DNA糖基化酶。9.權(quán)利要求1的組合物，其包含在熱活化的聚合酶的熱活化期期間和/或之后足以以下列速率從DNA中除去尿嘧啶的量或濃度的尿嘧啶-DNA糖基化酶，所述速率為在熱活化的聚合酶的熱活化期之前尿嘧啶-DNA糖基化酶除去堿基的速率的至少30%。10.權(quán)利要求1的組合物，其包含在熱活化的聚合酶的熱活化期期間和/或之后足以從損壞的核酸中除去尿嘧啶的量或濃度的尿嘧啶-DNA糖基化酶。11.組合物，其包括包含靶序列的靶核酸、聚合酶、從DNA中除去尿嘧啶和在脫堿基位點(diǎn)上切割DNA的酶和包含尿嘧啶堿基的損壞的核酸。12.組合物，其包括包含靶序列的靶核酸、聚合酶、從DNA中除去尿嘧啶的酶、在脫堿基位點(diǎn)上切割DNA的酶和包含尿嘧啶堿基的損壞的核酸。13.用于檢測(cè)核酸的試劑盒，所述試劑盒包括: a)包含熱活化的聚合酶的第一容器；和 b)包含熱穩(wěn)定的尿嘧啶-DNA糖基化酶的第二容器。14.用于檢測(cè)核酸的試劑盒，所述試劑盒包括包含熱活化的聚合酶和熱穩(wěn)定的尿嘧啶-DNA糖基化酶的容器。15.權(quán)利要求13或14中任一項(xiàng)的試劑盒，其還包括對(duì)照核酸。16.用于檢測(cè)核酸的試劑盒，所述試劑盒包括: a)包含熱活化的聚合酶的第一容器；和 b)包含從DNA中除去尿嘧啶的酶的第二容器。17.用于檢測(cè)核酸的試劑盒，所述試劑盒包括: a)包含熱活化的聚合酶的第一容器；和 b)包含從DNA中除去尿嘧啶和在脫堿基位點(diǎn)上切割DNA的酶的第二容器。18.用于檢測(cè)核酸的試劑盒，所述試劑盒包括: a)包含熱活化的聚合酶的第一容器； b)包含從DNA中除去尿嘧啶的酶的第二容器； c)包含在脫堿基位點(diǎn)上切割DNA的酶的第三容器。19.用于檢測(cè)核酸的試劑盒，所述試劑盒包括: a)包含熱活化的聚合酶的第一容器；和 b)包含從DNA中除去尿嘧啶的酶和在脫堿基位點(diǎn)上切割DNA的酶的第二容器。20.用于檢測(cè)包含靶序列的靶核酸的方法，所述方法包括: a)提供包含靶核酸的樣品； b)加入至少0.1-1.0單位的尿啼啶-DNA糖基化酶和樣品的一部分至反應(yīng)混合物； c)將尿嘧啶-DNA糖基化酶暴露于其中如果損壞的核酸存在的話(huà)，尿嘧啶-DNA糖基化酶從損壞的核酸切除尿嘧啶堿基的條件； d)熱循環(huán)反應(yīng)混合物，以產(chǎn)生包含靶序列的擴(kuò)增子；和 e)檢測(cè)包含靶序列的擴(kuò)增子。21.權(quán)利要求20的方法，其中所述尿嘧啶-DNA糖基化酶是熱穩(wěn)定的尿嘧啶-DNA糖基化酶。22.權(quán)利要求20的方法，其中所述反應(yīng)混合物包含聚合酶，和所述方法還包括將反應(yīng)混合物暴露于使聚合酶活化的溫度。23.權(quán)利要求20的方法，包含在熱活化的聚合酶的熱活化期期間和/或之后足以以下列速率從DNA中除去尿嘧啶的量或濃度的尿嘧啶-DNA糖基化酶，所述速率為在熱活化的聚合酶的熱活化期之前尿嘧啶-DNA糖基化酶除去堿基的速率的至少30%。24.權(quán)利要求20的方法，其中所述損壞的核酸未擴(kuò)增和/或未檢出。25.權(quán)利要求20的方法，其中所述損壞的核酸擴(kuò)增少于靶核酸。26.權(quán)利要求20的方法，其中所述檢測(cè)包括使用標(biāo)記的探針。27.權(quán)利要求20的方法，其中所述聚合酶是熱活化的聚合酶。28.權(quán)利要求20的方法，其中所述損壞的核酸存在和包含尿嘧啶堿基。29.權(quán)利要求20的方法，其中所述損壞的核酸存在和包含脫氨的胞嘧啶。30.權(quán)利要求20的方法，其中所述靶序列是單核苷酸多態(tài)性。31.權(quán)利要求20的方法，其中所述靶序列包含胞嘧啶或鳥(niǎo)嘌呤。32.用于檢測(cè)包含靶序列的靶核酸的方法，所述方法包含: a)提供包含靶核酸的樣品； b)加入至少0.1-1.0單位的從DNA中除去尿嘧啶的酶和樣品的一部分至反應(yīng)混合物； c)將酶暴露于其中如果損壞的核酸存在的話(huà)，酶從損壞的核酸切除尿嘧啶堿基的條件； d)熱循環(huán)反應(yīng)混合物，以產(chǎn)生包含靶序列的擴(kuò)增子；和 e)檢測(cè)包含靶序列的擴(kuò)增子。33.權(quán)利要求32的方法，其中所述酶還在脫堿基位點(diǎn)上切割DNA。34.權(quán)利要求32的方法，其還提供在脫堿基位點(diǎn)上切割DNA的酶。35.用于檢測(cè)包含靶序列的靶核酸的方法，所述方法包括: a)提供包含靶核酸的樣品； b)加入至少0.1-1.0單位的尿啼啶-DNA糖基化酶和樣品的一部分至反應(yīng)混合物； c)將尿嘧啶-DNA糖基化酶暴露于其中如果損壞的核酸存在的話(huà)，尿嘧啶-DNA糖基化酶從損壞的核酸切除尿嘧啶堿基的條件； d)熱循環(huán)反應(yīng)混合物，以產(chǎn)生包含靶序列的擴(kuò)增子；和 e)使擴(kuò)增子與對(duì)靶序列特異性的核酸探針接觸， 其中如果探針與靶序列雜交，則檢出靶核酸。36.權(quán)利要求35的方法，其中所述尿嘧啶-DNA糖基化酶是熱穩(wěn)定的尿嘧啶-DNA糖基化酶。37.權(quán)利要求35的方法，其中所述反應(yīng)混合物包含聚合酶，和所述方法還包括將反應(yīng)混合物暴露于使聚合酶活化的溫度。38.權(quán)利要求35的方法，包括在熱活化的聚合酶的熱活化期期間和/或之后足以以下列速率從DNA中除去尿嘧啶的量或濃度的尿嘧啶-DNA糖基化酶，所述速率為在熱活化的聚合酶的熱活化期之前尿嘧啶-DNA糖基化酶除去堿基的速率的至少30%。39.權(quán)利要求35的方法，其中所述損壞的核酸未擴(kuò)增和/或未檢出。40.權(quán)利要求35的方法，其中所述損壞的核酸擴(kuò)增少于靶核酸。41.權(quán)利要求35的方法，其中所述檢測(cè)包括使用標(biāo)記的探針。42.權(quán)利要求35的方法，其中所述聚合酶是熱活化的聚合酶。43.權(quán)利要求35的方法，其中所述損壞的核酸存在和包含尿嘧啶堿基。44.權(quán)利要求35的方法，其中所述損壞的核酸存在和包含脫氨的胞嘧啶。45.權(quán)利要求35的方法，其中所述靶序列是單核苷酸多態(tài)性。46.權(quán)利要求35的方法，其中所述靶序列包含胞嘧啶或鳥(niǎo)嘌呤。47.用于檢測(cè)包含靶序列的靶核酸的方法，所述方法包括: a)提供包含靶核酸的樣品； b)加入至少0.1-1.0單位的從DNA中除去尿嘧啶的酶和樣品的一部分至反應(yīng)混合物； c)將酶暴露于其中如果損壞的核酸存在的話(huà)，酶從損壞的核酸切除尿嘧啶堿基的條件； d)熱循環(huán)反應(yīng)混合物，以產(chǎn)生包含靶序列的擴(kuò)增子；和 e)使擴(kuò)增子與對(duì)靶序列特異性的核酸探針接觸， 其中如果探針與靶序列雜交，則檢出靶核酸。48.權(quán)利要求47的方法，其中所述酶還在脫堿基位點(diǎn)上切割DNA。49.權(quán)利要求47的方法，還提供在脫堿基位點(diǎn)上切割DNA的酶。50.用于檢測(cè)包含靶序列的靶核酸的方法，所述方法包括: a)提供包含靶核酸的樣品； b)加入至少0.1-1.0單位的從DNA中除去尿嘧啶的酶和樣品的一部分至反應(yīng)混合物； c)將酶暴露于其中如果損壞的核酸存在的話(huà)，酶從損壞的核酸切除尿嘧啶堿基的條件； d)熱循環(huán)反應(yīng)混合物，以產(chǎn)生包含靶序列的擴(kuò)增子；和 e)將擴(kuò)增子測(cè)序，以檢測(cè)擴(kuò)增子的核酸序列， 其中當(dāng)擴(kuò)增子的核酸序列包含靶序列時(shí)，檢出靶核酸。51.用于檢測(cè)包含靶序列的靶核酸的方法，所述方法包括: a)提供包含靶核酸的樣品； b)加入至少0.1-1.0單位的從DNA中除去尿嘧啶的酶和樣品的一部分至反應(yīng)混合物； c)將酶暴露于其中如果損壞的核酸存在的話(huà)，酶從損壞的核酸切除尿嘧啶堿基的條件； d)熱循環(huán)反應(yīng)混合物，以產(chǎn)生包含靶序列的擴(kuò)增子；和 e)通過(guò)質(zhì)譜法探詢(xún)擴(kuò)增子，以檢測(cè)擴(kuò)增子的化學(xué)組成， 其中當(dāng)擴(kuò)增子的化學(xué)組成與靶序列的化學(xué)組成匹配時(shí)，檢出靶核酸。52.用于檢測(cè)包含靶序列的靶核酸的方法，所述方法包括: a)提供包含靶核酸的樣品；b)加入至少0.1-1.0單位的從DNA中除去尿嘧啶的酶和樣品的一部分至反應(yīng)混合物； c)將酶暴露于其中如果損壞的核酸存在的話(huà)，酶從損壞的核酸切除尿嘧啶堿基的條件； d)熱循環(huán)反應(yīng)混合物，以產(chǎn)生包含靶序列的擴(kuò)增子；和 e)使擴(kuò)增子與限制性核酸內(nèi)切酶接觸，以產(chǎn)生限制性圖譜， 其中當(dāng)擴(kuò)增子的限制性圖譜與靶序列的限制性圖譜匹配時(shí)，檢出靶核酸。53.用于檢測(cè)包含靶序列的靶核酸的方法，所述方法包括: a)提供包含靶核酸的樣品；b)加入至少0.1-1.0單位的從DNA中除去尿嘧啶的酶和樣品的一部分至反應(yīng)混合物； c)將酶暴露于其中如果損壞的核酸存在的話(huà)，酶從損壞的核酸切除尿嘧啶堿基的條件； d)熱循環(huán)反應(yīng)混合物，以產(chǎn)生包含靶序列的擴(kuò)增子；和 e)使擴(kuò)增子與瓣?duì)詈怂醿?nèi)切酶接觸， 其中當(dāng)瓣?duì)詈怂醿?nèi)切酶切割產(chǎn)物檢出時(shí)，檢出靶核酸。54.用于檢測(cè)包含靶序列的靶核酸的方法，所述方法包括: a)提供包含靶核酸的樣品；b)加入至少0.1-1.0單位的從DNA中除去尿嘧啶的酶和樣品的一部分至反應(yīng)混合物； c)將酶暴露于其中如果損壞的核酸存在的話(huà)，酶從損壞的核酸切除尿嘧啶堿基的條件； d)熱循環(huán)反應(yīng)混合物，以產(chǎn)生包含靶序列的擴(kuò)增子；和 e)使擴(kuò)增子與引物延伸測(cè)定法的引物、核苷酸和聚合酶接觸， 其中當(dāng)聚合酶將核苷酸添加至引物上時(shí)，檢出靶核酸。55.用于檢測(cè)包含靶序列的靶核酸的方法，所述方法包括: a)提供包含靶核酸的樣品；b)加入至少0.1-1.0單位的從DNA中除去尿嘧啶的酶和樣品的一部分至反應(yīng)混合物； c)將酶暴露于其中如果損壞的核酸存在的話(huà)，酶從損壞的核酸切除尿嘧啶堿基的條件； d)熱循環(huán)反應(yīng)混合物，以產(chǎn)生包含靶序列的擴(kuò)增子；和 e)使擴(kuò)增子與第一寡核苷酸、第二寡核苷酸和連接酶接觸， 其中當(dāng)連接酶連接第一和第二寡核苷酸時(shí)，檢出靶核酸。56.用于檢測(cè)包含靶序列的靶核酸的方法，所述方法包括: a)提供包含靶核酸的樣品；b)加入至少0.1-1.0單位的從DNA中除去尿嘧啶的酶和樣品的一部分至反應(yīng)混合物； c)將酶暴露于其中如果損壞的核酸存在的話(huà)，酶從損壞的核酸切除尿嘧啶堿基的條件； d)熱循環(huán)反應(yīng)混合物，以產(chǎn)生包含靶序列的擴(kuò)增子；和 e)檢測(cè)擴(kuò)增子的物理性質(zhì)， 其中當(dāng)擴(kuò)增子的物理性質(zhì)與靶序列的物理性質(zhì)匹配時(shí)，檢出靶核酸。57.用于使包含靶序列的擴(kuò)增子的序列錯(cuò)誤最小化的擴(kuò)增方法，所述方法包括: a)提供包含靶核酸的樣品，所述靶核酸包含靶序列； b)加入至少0.1-1.0單位的從DNA中除去尿嘧啶的酶和樣品的一部分至反應(yīng)混合物； c)將酶暴露于其中如果損壞的核酸存在的話(huà)，酶從損壞的核酸切除尿嘧啶堿基的條件；和 d)熱循環(huán)反應(yīng)混合物，以產(chǎn)生包含靶序列的擴(kuò)增子， 其中相對(duì)于在缺少至少0.1-1.0單位的從DNA中除去尿嘧啶的酶的情況下產(chǎn)生的擴(kuò)增子，所述擴(kuò)增子包含更少的自胞嘧啶的脫氨作用產(chǎn)生的序列錯(cuò)誤。58.用于使包含靶序列的擴(kuò)增子的序列錯(cuò)誤最小化的擴(kuò)增方法，所述方法包括: a)提供包含靶核酸的樣品，所述靶核酸包含靶序列； b)加入至少0.1-1.0單位的從DNA中除去尿嘧啶的酶和樣品的一部分至反應(yīng)混合物； c)將酶暴露于其中如果損壞的核酸存在的話(huà)，酶從損壞的核酸切除尿嘧啶堿基的條件；和 d)熱循環(huán)反應(yīng)混合物，以產(chǎn)生包含靶序列的擴(kuò)增子， 其中通過(guò)與樣品中的靶核酸的靶序列比對(duì)或比較測(cè)定的擴(kuò)增子的靶序列中的錯(cuò)配的第一數(shù)量小于通過(guò)與樣品中的靶核酸的靶序列比對(duì)或比較測(cè)定的在缺少?gòu)腄NA中除去尿嘧啶的酶的情況下產(chǎn)生的擴(kuò)增子的靶序列中的錯(cuò)配的第二數(shù)量。59.用于使包含靶序列的擴(kuò)增子的序列錯(cuò)誤最小化的擴(kuò)增方法，所述方法包括: a)提供包含靶核酸的樣品，所述靶核酸包含靶序列； b)加入至少0.1-1.0單位的從DNA中除去尿嘧啶的酶和樣品的一部分至反應(yīng)混合物； c)將酶暴露于其中如果損壞的核酸存在的話(huà)，酶從損壞的核酸切除尿嘧啶堿基的條件；然后 d)熱循環(huán)反應(yīng)混合物，以產(chǎn)生包含靶序列的擴(kuò)增子， 其中相對(duì)于在缺少至少0.1-1.0單位的從DNA中除去尿嘧啶的酶的情況下產(chǎn)生的擴(kuò)增子，所述擴(kuò)增子包含更少的自胞嘧啶的脫氨作用產(chǎn)生的序列錯(cuò)誤。60.用于使包含靶序列的擴(kuò)增子的序列錯(cuò)誤最小化的擴(kuò)增方法，所述方法包括: a)提供包含靶核酸的樣品，所述靶核酸包含靶序列； b)加入至少0.1-1.0單位的從DNA中除去尿嘧啶的酶和樣品的一部分至反應(yīng)混合物； c)將酶暴露于其中如果損壞的核酸存在的話(huà)，酶從損壞的核酸切除尿嘧啶堿基的條件；然后 d)熱循環(huán)反應(yīng)混合物，以產(chǎn)生包含靶序列的擴(kuò)增子， 其中通過(guò)與樣品中的靶核酸的靶序列比對(duì)或比較測(cè)定的擴(kuò)增子的靶序列中的錯(cuò)配的第一數(shù)量小于通過(guò)與樣品中的靶核酸的靶序列比對(duì)或比較測(cè)定的在缺少?gòu)腄NA中除去尿嘧啶的酶的情況下產(chǎn)生的擴(kuò)增子的靶序列中的錯(cuò)配的第二數(shù)量。
【專(zhuān)利摘要】本文提供涉及核酸的酶修飾的技術(shù)，和特別但不限于涉及使用尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶以使由胞嘧啶殘基的脫氨作用導(dǎo)致的DNA序列的錯(cuò)誤最小化或消除所述錯(cuò)誤的方法和組合物。
【IPC分類(lèi)】C12N9/24, C12P19/34, C12Q1/68
【公開(kāi)號(hào)】CN105378109
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201480027368
【發(fā)明人】A.夏, W.蔡
【申請(qǐng)人】雅培分子公司
【公開(kāi)日】2016年3月2日
【申請(qǐng)日】2014年3月13日
【公告號(hào)】CA2905429A1, EP2971175A2, US20140274736, WO2014160254A2, WO2014160254A3