嵌合抗原受體及其基因和重組表達載體、工程化cd138靶向性的nkt細胞及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于腫瘤生物制品領(lǐng)域，具體地，涉及過繼免疫治療中的一種嵌合抗原受 體⑶138ScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ及其基因和重組表達載體、工程化⑶138靶向性的NKT細 胞（CAR138-NKT細胞）及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 自然殺傷細胞（NKT)是一種特殊類型的T淋巴細胞亞群，具有T細胞和NK細胞細 胞兩重性質(zhì)。NKT細胞能表達T細胞的TCR與NK細胞的NKR-Pl兩種受體，在TCR和NKR介導(dǎo) 下，NKT細胞能夠產(chǎn)生大量的IL-4及INF γ，對腫瘤細胞發(fā)揮細胞殺傷作用。NKT細胞通過自 身表面的⑶16與特異性抗體的Fc段結(jié)合，發(fā)揮ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)作用。但在抗體依賴的細胞介導(dǎo)的殺傷作用過程中，由于抗體能與革El細胞上 的相應(yīng)抗原表位特異性結(jié)合，NKT細胞可殺傷任何已與抗體結(jié)合的靶細胞，因此抗體與靶細 胞上的抗原結(jié)合是特異性的，但NKT細胞對靶細胞的殺傷作用是非特異性的。另外，通常情 況下，輸注的NKT細胞在患者體內(nèi)半衰期為2周左右，有效期短暫，需要反復(fù)多次輸注。另 外，NKT細胞本身缺少特異性抗體，不足以在腫瘤周圍或者瘤巢中富集，制約了 NKT細胞對 惡性腫瘤的靶向治療。而且，研究表明，NKT細胞不是對所有的腫瘤都有殺傷效果，對部分 腫瘤的殺傷作用比較弱，特異殺傷活性有待提高。
[0003] 多發(fā)性骨髓瘤（Multiple myeloma，MM)是漿細胞異常增生的B細胞惡性腫瘤，以 骨髓中積聚大量的惡性漿細胞并分泌單克隆免疫球蛋白為特征。骨髓瘤細胞表面表達一系 列的粘附分子如CD138。CD138是一種屬于跨膜粘蛋白聚糖家族成員，與骨髓微環(huán)境中的生 長因子和基質(zhì)成分相結(jié)合，介導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細胞的粘附和歸巢。隨著對CD138研究的逐 步深入，人們發(fā)現(xiàn)CD138在機體的損傷修復(fù)及腫瘤的生長、迀移中都起了關(guān)鍵作用。目前 CD138被認為是漿細胞最特異的表面標(biāo)志物，研究顯示，CD138分子在B細胞惡性腫瘤中的 表達非常復(fù)雜，在MM患者骨髓和外周血中的漿細胞表達，而骨髓中的造血前體細胞或淋巴 細胞不表達。CD138分子水平的升高可以作為骨髓瘤預(yù)后不良的獨立指標(biāo)，并且當(dāng)MM細胞 呈現(xiàn)凋亡時，膜表面CD138分子表達下調(diào)或丟失，可反映 MM患者體內(nèi)腫瘤細胞的負荷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中NKT細胞對腫瘤的殺傷作用比較弱、特異殺 傷活性有待提高的缺陷，提供一種嵌合抗原受體⑶138ScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ及其基因和 重組表達載體、工程化⑶138靶向性的NKT細胞（CAR138-NKT細胞）及其應(yīng)用，嵌合抗原受 體⑶138ScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ修飾的NKT細胞在治療進展期⑶138陽性的多發(fā)性骨髓瘤 時，對骨髓瘤細胞具有很好的特異殺傷活性，且對已經(jīng)過多次治療（如放療、化療及其他藥 物對癥治療等）但均無明顯療效的進展期CD138陽性的多發(fā)性骨髓瘤患者有一定的治療效 果。
[0005] 本發(fā)明的發(fā)明人在研究中意外發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的嵌合抗原受體 CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ對NKT細胞具有高的感染效率，且感染后得到的CAR138-NKT 細胞在體外有高效的殺瘤活性，同時采用CAR138-NKT細胞治療進展期CD138陽性的多發(fā)性 骨髓瘤時，對骨髓瘤細胞具有很好的特異殺傷活性，且對已經(jīng)過多次治療（如放療、化療及 其他藥物對癥治療等）但均無明顯療效的進展期CD138陽性的多發(fā)性骨髓瘤患者有一定的 治療效果。
[0006] 因此，為了實現(xiàn)上述目的，第一方面，本發(fā)明提供了一種嵌合抗原受體，所述嵌合 抗原受體為 CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ，由 CD138ScFv、CD8 的鉸鏈區(qū)（hinge 區(qū)）和跨膜 區(qū)、CD137的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域和CD3 ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域串聯(lián)構(gòu)成。
[0007] 第二方面，本發(fā)明提供了編碼上述嵌合抗原受體的基因。
[0008] 第三方面，本發(fā)明提供了含有上述基因的重組表達載體。
[0009] 第四方面，本發(fā)明提供了一種工程化⑶138靶向性的NKT細胞，所述NKT細胞是上 述嵌合抗原受體CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ修飾的NKT細胞。
[0010] 第五方面，本發(fā)明提供了上述工程化⑶138靶向性的NKT細胞在制備用于治療腫 瘤的制劑中的應(yīng)用。
[0011] 在治療進展期CD138陽性的多發(fā)性骨髓瘤時，本發(fā)明的嵌合抗原受體 CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ對NKT細胞具有高的感染效率，且感染后得到的CAR138-NKT 細胞，即工程化CD138靶向性的NKT細胞，在體外具有高效的殺瘤活性，在體內(nèi)能夠不依賴 于白介素2而持續(xù)長久的存在，且能夠特異性結(jié)合CD138抗原，明顯延長免疫細胞在患者體 內(nèi)的存活時間，增強免疫細胞靶向識別骨髓瘤細胞CD138抗原的能力，加強對骨髓瘤細胞 的特異殺傷活性，而且對已經(jīng)過多次治療（如放療、化療及其他藥物對癥治療等）但均無明 顯療效的進展期CD138陽性的多發(fā)性骨髓瘤患者，本發(fā)明的CAR138-NKT細胞具有較低的毒 副作用，患者具有較好的耐受性，并且發(fā)揮一定的治療效果。本發(fā)明的工程化CD138靶向性 的NKT細胞為治療進展期CD138陽性的多發(fā)性骨髓瘤提供了一種新的選擇，具有良好的產(chǎn) 業(yè)應(yīng)用前景。
[0012] 本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。
【附圖說明】
[0013] 圖1為流式細胞術(shù)對分離培養(yǎng)的NKT細胞表型分析的結(jié)果。
[0014] 圖2為本發(fā)明的慢病毒表達載體pWPT-⑶8-⑶137-⑶3 ζ的限制性內(nèi)切酶MluI/ Sail雙酶切片段的電泳鑒定圖。
[0015] 圖3為本發(fā)明的慢病毒表達載體pWPT-CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ的限制性內(nèi) 切酶BamHI/Sall雙酶切片段的電泳鑒定圖。
[0016] 圖4為本發(fā)明的慢病毒表達載體pWPT-CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ的結(jié)構(gòu)示意 圖，其中，逆時針序列為正向基因片度，順時針為反向基因片段。
[0017] 圖5為流式細胞術(shù)檢測含有嵌合抗原受體⑶138ScFv_⑶8-⑶137-⑶3 ζ的病毒濃 縮液對NKT細胞的感染效率。
[0018] 圖6為流式細胞術(shù)檢測嵌合抗原受體CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ修飾的NKT細 胞（CAR138-NKT細胞）表型鑒定的結(jié)果。
[0019] 圖7為本發(fā)明的CAR138-NKT細胞對人多發(fā)性骨髓瘤細胞的殺傷作用的細胞毒性 分析圖。
[0020] 圖8為本發(fā)明的CAR138-NKT細胞對進展期⑶138陽性的多發(fā)性骨髓瘤患者的治 療過程中，患者外周血中骨髓瘤細胞數(shù)目的變化曲線圖。
[0021] 圖9為本發(fā)明的CAR138-NKT細胞輸注至進展期⑶138陽性的多發(fā)性骨髓瘤患者 體內(nèi)后，患者外周血中漿細胞比例的變化圖。
[0022] 圖10為本發(fā)明的CAR138-NKT細胞治療進展期⑶138陽性的多發(fā)性骨髓瘤患者 后，患者骨髓中漿細胞數(shù)目的變化圖。
【具體實施方式】
[0023] 以下對本發(fā)明的【具體實施方式】進行詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體 實施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0024] 本發(fā)明提供了 一種嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體為 CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ，由CD138ScFv、CD8的鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的胞內(nèi)信號結(jié) 構(gòu)域和CD3 ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域串聯(lián)構(gòu)成。優(yōu)選情況下，嵌合抗原受體的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
[0025] 本發(fā)明提供了編碼上述嵌合抗原受體的基因。優(yōu)選情況下，編碼上述嵌合抗原受 體的基因的核苷酸序列如SEQID NO. 2所示。
[0026] 本發(fā)明提供了含有上述基因的重組表達載體。優(yōu)選情況下，重組表達載體為慢病 毒表達載體。對于慢病毒表達載體沒有特別的限定，只要能夠與輔助載體共轉(zhuǎn)染包裝細胞 如293T包裝細胞，獲得病毒濃縮液及嵌合抗原受體⑶138ScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ修飾的 NKT細胞即可，優(yōu)選情況下，慢病毒表達載體為pWPT-CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ。
[0027] 對于慢病毒表達載體pWPT-CD138ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ的制備方法沒有特 別的限定，可以為本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的各種方法，優(yōu)選情況下，慢病毒表達載體 pWPT-CD138ScFv-CD8-CD137-CD3G的制備方法包括以下步驟：
[0028] (1)從NKT細胞cDNA中分別擴增CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的胞 內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域和CD3G的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域