用于檢測細胞遷移的微流控芯片的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領域，特別涉及微流控芯片。
【背景技術】
[0002] 微流控（Microfluidics)指的是使用微管道（尺寸為數(shù)十到數(shù)百微米）處理或操 縱微小流體（體積為納升到阿升）的系統(tǒng)所涉及的科學和技術，是一門涉及化學、流體物 理、微電子、新材料、生物學和生物醫(yī)學工程的新興交叉學科。因為具有微型化、集成化等特 征，微流控裝置通常被稱為微流控芯片，也被稱為芯片實驗室（Lab on a Chip)和微全分析 系統(tǒng)（micro-Total Analytical System)。微流控的早期概念可以追溯到19世紀70年代 采用光刻技術在硅片上制作的氣相色譜儀，而后又發(fā)展為微流控毛細管電泳儀和微反應器 等。微流控的重要特征之一是微尺度環(huán)境下具有獨特的流體性質，如層流和液滴等。借助 這些獨特的流體現(xiàn)象，微流控可以實現(xiàn)一系列常規(guī)方法所難以完成的微加工和微操作。目 前，微流控被認為在生物醫(yī)學研究中具有巨大的發(fā)展?jié)摿蛷V泛的應用前景。
[0003] 細胞迀移（cell migration)也稱為細胞爬行、細胞移動或細胞運動，是指細胞在 接收到迀移信號或感受到某些物質的梯度后而產(chǎn)生的移動。細胞迀移為細胞頭部偽足的延 伸、新的黏附建立、細胞體尾部收縮在時空上的交替過程。細胞迀移是正常細胞的基本功能 之一，是機體正常生長發(fā)育的生理過程，也是活細胞普遍存在的一種運動形式。胚胎發(fā)育、 血管生成、傷口愈合、免疫反應、炎癥反應、動脈粥樣硬化、癌癥轉移等過程中都涉及細胞迀 移。
[0004] 申請人為重慶醫(yī)科大學、申請?zhí)枮?01010164032. 7的中國專利介紹了一種用于 檢測細胞迀移的瓊脂糖凝膠微流動腔裝置，包括口字型有機玻璃框及墊在所述口字型有機 玻璃框下的一塊載玻片，所述口字型有機玻璃框內灌注瓊脂糖凝膠；三條處于同一深度的 平行微通道貫穿于瓊脂糖凝膠內，口字型有機玻璃框的兩側壁鑿有導入口和導出口；進液 管和出液管通過導入口和導出口插入凝膠中，與兩側的微通道相連；本裝置制作工藝簡單， 密封性好，能在較短的時間內產(chǎn)生穩(wěn)定的濃度梯度，可廣泛運用于各類細胞迀移試驗中。該 微流控芯片雖然能很穩(wěn)定的產(chǎn)生濃度梯度，但是，所產(chǎn)生的濃度梯度為單因素的；而多因素 多維度的濃度梯度更接近體內的環(huán)境。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種微流控裝置，其能夠產(chǎn)生多維度的濃度梯度，營 造較為復雜的濃度梯度環(huán)境。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案為：
[0007] -種微流控裝置，包括單元A、單元B和連接所述單元A和所述單元B之間的圓環(huán) 毛細管道；所述的圓環(huán)毛細管道可以由硅膠管制成。所述單元A包括平行于同一平面的三 根通道。所述三根通道可以為圓柱體，被包埋與機制材料中。三根通道依次為高濃度液體 通道、細胞培養(yǎng)通道和緩沖液通道，所述三根通道在近所述圓環(huán)毛細管道端兩兩通過垂直 相交的側支通道相連通，所述細胞培養(yǎng)通道同所述圓環(huán)毛細管道相連通；所述側支通道可 以是毛細管，也可以不是，但所述側支通道的半徑要小于主通道（即高濃度液體通道、細胞 培養(yǎng)通道和緩沖液通道），其中，所述高濃度液體通道和所述緩沖液通道最好是等徑。所述 單元B包括高濃度液體池和毛細管道，所述圓環(huán)毛細管道和所述高濃度液體池通過所述毛 細管道相連通。
[0008] 作為優(yōu)選的方案，所述單元A由高強度瓊脂糖凝膠制成，所述單元B由PDMS制成。 高強度瓊脂糖凝膠可以很快速的實現(xiàn)濃度梯度穩(wěn)定。
[0009] 作為優(yōu)選的方案，所述的微流控裝置所述單元A中的所述所述高濃度液體通道的 下方設置有與之平行的緩沖液通道II。
[0010] 進一步，所述的微流控裝置，高濃度液體通道、緩沖液通道和緩沖液通道II均設置 有進液管道和出液管道。
[0011] 進一步，所述的微流控裝置，所述單元A下方有載玻片，便于在顯微鏡下觀察細 胞。
[0012] 進一步，所述的微流控裝置，所述圓環(huán)毛細管道由透明材質制成。
[0013] 進一步，所述的微流控裝置，所述細胞培養(yǎng)通道與所述毛細管道位于同一水平位 置，或是同一直線水平位置。
[0014] 進一步，所述的微流控裝置，所述圓環(huán)毛細管道設置有刻度?？潭缺阌诙ㄎ患毎?迀移情況，也便于量化分析細胞迀移。
[0015] 本發(fā)明的目的之二在于提供一種檢測細胞迀移的方法，該方法是利用上述微流控 裝置作為檢測工具的，可以實現(xiàn)多維度濃度梯度影響下的細胞迀移實驗。
[0016] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案為：
[0017] 運用所述的微流控裝置檢測細胞迀移的方法：
[0018] 1)在細胞培養(yǎng)通道中培養(yǎng)細胞24小時，拍照，得照片A ; -般培養(yǎng)24小時候，細胞 都能在細胞培養(yǎng)通道中較好的生長，有時候，有的細胞只需要8個小時。2)同時在所述高濃 度液體池中添加待測液體或趨化因子（含有細胞喜好的物質），同時勻速在所述高濃度液 體通道中通入所述待測液體，同時開啟恒速栗在所述緩沖液通道和/或緩沖液通道II中通 入空白緩沖溶液，使瓊脂糖凝膠中形成濃度梯度；通道中液體的輸送可以借助恒速栗進行。 3)保持瓊脂糖凝膠中的濃度梯度持續(xù)不少于8小時，觀察細胞并拍照，得照片B ;4)比較照 片A和照片B中的區(qū)別。
[0019] 作為優(yōu)選的方案，所述的微流控裝置檢測細胞迀移的方法，步驟1)中所述細胞為 血管內皮細胞。
[0020] 作為優(yōu)選的方案，所述的方法步驟4)中通過比較照片A和照片B中的區(qū)別，分析 細胞遷移結果。
[0021] 本發(fā)明的有益效果在于：1)本裝置可以產(chǎn)生多維的濃度梯度，其中，"一維"是由 高濃度液體通道和緩沖液通道中分別流動的高濃度液體和空白緩沖液體所產(chǎn)生的；"另一 維"是由高濃度液體通道和緩沖液通道II中分別流動的高濃度液體和空白緩沖液體所產(chǎn)生 的；還有"一維"是由B單元（高濃度液體池）和A單元產(chǎn)生的。2)本裝置可以定位和統(tǒng)計 細胞的迀移情況，主要是圓環(huán)毛細管道設置有刻度，這樣可以統(tǒng)計單因素、雙因素或三因素 的濃度梯度情況下細胞的迀移情況，比起傳統(tǒng)的transwell小室檢測細胞迀移更科學和系 統(tǒng)。3)本裝置檢測濃度梯度可以精確到毫秒。
[0022] 更多的有益效果，詳見【具體實施方式】。
【附圖說明】
[0023] 圖1為所述微流控裝置的俯視的結構示意圖。
[0024] 圖2為所述微流控裝置的側視的結構示意圖。
[0025] 圖3為Transwell小室細胞迀移實驗中含空白溶液的實驗結果圖。
[0026] 圖4為Transwell小室細胞迀移實驗中的含趨化因子溶液的實驗結果圖。
[0027] 圖5為照片A。
[0028] 圖6為照片B。
【具體實施方式】
[0029] 一微流控芯片
[0030] -種微流控裝置，如圖1或圖2所示，包括單元A1、單元B2和連接所述單元A和 所述單元B之間的圓環(huán)毛細管道3 ;所述單元A包括平行于同一平面的三根通道，依次為高 濃度液體通道4 (直徑為100 μ m)、細胞培養(yǎng)通道5 (直徑為1mm)和緩沖液通道6 (直徑為 100 μ m)，所述三根通道在近所述圓環(huán)毛細管道端兩兩通過垂直相交的側支通道7相連通， 所述細胞培養(yǎng)通道同所述圓環(huán)毛細管道相連通；所述單元B2包括高濃度液體池8和毛細管 道9,所述圓環(huán)毛細管道和所述高濃度液體池通過所述毛細管道相連通；所述單元A由高強 度瓊脂糖凝膠制成，所述單元B由PDMS制成。所述單元A中的所述所述高濃度液體通道的 下方設置有與之平行的緩沖液通道II 10 (直徑為100 μ m)。高濃度液體通道4、緩沖液通道 6和緩沖液通道II 10均設置有進液管道和出液管道。所述單元A下方有載玻片。所述圓環(huán) 毛細管道由透明材質制成。所述細胞培養(yǎng)通道與所述毛細管道位于同一水平位置。所述圓 環(huán)毛細管道設置有刻度。
[0031] 上述裝置的制備可參照申請?zhí)枮?01010164032. 7和201010164041. 6中提及的方 法制備。也可以直接委托微流控加工企業(yè)或實驗室制作（如大連物化所）。由于微流控芯 片的制備是非常成熟且商業(yè)化的，在此就不過多的描述其制備工藝過程了。
[0032] 二濃度梯度檢測
[0033] (一）一維濃度梯度的檢測
[0034] 將通道各自的進液管同微注射栗相連，同高濃度液體通道4相連接的注射器中裝 有按標準方法配置的熒光素溶液，同緩沖液通道6相連接的注射器中裝有蒸餾水，高濃度 液體池8不填充液體，緩沖液通道II 10不連接注射栗。微注射栗的流速設定為50Ml/min， 將熒光素溶液和蒸餾水接觸瓊脂糖凝膠起設定為t = 0。采用倒置熒光顯微鏡（Olympus 1X51)拍攝通道中的熒光強度圖片，
[0035] 實驗前十分鐘內每十分鐘