一種自生固氮菌mbc8及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物固氮領(lǐng)域，具體涉及一種自生固氮菌MBC8及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]荒漠生態(tài)系統(tǒng)占全球面積的41 % (Delgado-Baquerizo, et al.，2013)，其凈初級生產(chǎn)力約占陸地生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力的20% (Whittaker，1975)。在荒漠生態(tài)系統(tǒng)當(dāng)中，土壤氮素養(yǎng)分的匱乏嚴(yán)重地限制了系統(tǒng)凈初級生產(chǎn)力(Asner，et al.，2003，Crutsinger，et al.,2013，Reich，et al., 2006) 0而且荒漠化還在進(jìn)一步發(fā)展，導(dǎo)致了土地退化，氮素養(yǎng)分流失嚴(yán)重。
[0003]自然環(huán)境中的氮素輸入方式主要為生物固氮。固氮作用增加土壤可利用氮含量，為微生物和植物補(bǔ)充氮素促進(jìn)其生長和代謝，以增加生態(tài)系統(tǒng)的初級生產(chǎn)力，并且對于生態(tài)系統(tǒng)的氮素循環(huán)也有著至關(guān)重要的作用。生物固氮主要有共生固氮和自生固氮。由于荒漠地區(qū)環(huán)境條件惡劣，植被稀少，因此可以進(jìn)行共生固氮的豆科植物也十分稀少，自生固氮是荒漠生態(tài)系統(tǒng)主要的氮素輸入方式。因此，自生固氮對于荒漠化防治工作和荒漠生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)有重大意義。
[0004]為了幫助荒漠化防治工作，對于荒漠土壤自生固氮菌的研究和應(yīng)用迫在眉睫。目前對于固氮細(xì)菌的報道仍以共生固氮菌為主，對于自生固氮菌的報道非常少。而且這些少量已知的自生固氮菌劑對環(huán)境溫度和濕度等環(huán)境條件均有要求，抗逆性較差，多應(yīng)用于農(nóng)田或者堆肥當(dāng)中，不適于環(huán)境條件惡劣的荒漠生態(tài)系統(tǒng)。
[0005]因此有必要提供一種抗逆性強(qiáng)、適用于荒漠生態(tài)系統(tǒng)的具有自生固氮能力的固氮菌株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種適用于干旱、溫差大、鹽堿災(zāi)害和高紫外線強(qiáng)度并且可以自生固氮的菌株，以增加土壤固氮活性和有效氮含量。
[0007]為達(dá)到以上目的，本發(fā)明提供了一種自生固氮菌(Rhizobium galegae)MBC8，其保藏號為CGMCC N0.10824，保藏日期為2015年5月19日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
[0008]上述菌株為山羊豆根瘤菌Rhizobium galegae。菌株Rhizobium galegae (菌種名)-MBC8(菌株名)，是將荒漠地區(qū)的表層土壤用無菌裝置采集低溫條件在帶回實驗室，經(jīng)過分離、純培養(yǎng)，革蘭氏染色、固氮活性檢測和16srDNA測序所得。
[0009]形態(tài)特性:通常為桿狀0.5一0.9X1.2一3.0 μ mD運(yùn)動；一根極生或亞極生邊貿(mào)、或兩根到六根周生鞭毛，不形成芽孢。好氧。格蘭仕染色陰性。
[0010]培養(yǎng)特性:在碳水化合物培養(yǎng)基上的生長常伴生有豐富的胞外多糖粘液。在阿須貝培養(yǎng)基上于28°C -30°c培養(yǎng)3-7天后，生長良好，菌落無色或白色。
[0011]生理特性:有機(jī)化能營養(yǎng)，呼吸代謝。不生成3-酮基葡萄糖苷，不液化明膠或者緩慢液化。不水解酪蛋白和洋菜。在硫酸鉍洋菜培養(yǎng)基上基友微量的H2S產(chǎn)生或者不產(chǎn)生。能利用很多碳水化合物，不形成氣體，但不利用纖維素或淀粉。能以銨鹽、硝酸鹽和大多數(shù)氨基酸作為氮源。
[0012]功能特性:通過斜面阿須貝培養(yǎng)基培養(yǎng)，用乙炔還原法測定，該菌株表現(xiàn)出了固氮活性。
[0013]本發(fā)明還提供了含有所述自生固氮菌MBC8的菌劑。所述菌劑可以為液體菌劑，也可以為固體菌劑。
[0014]可選的，所述菌劑中還含有菌體吸附材料，所述菌體吸附材料選自草炭、珍珠巖、蛭石粉和微粉碳酸鈣中的至少一種。
[0015]可選的，在所述菌劑中，自生固氮菌MBC8的含量為2.1 X 10s_2.9X 10scfu/g。
[0016]優(yōu)選的，在所述菌劑中，自生固氮菌MBC8的含量為2.9X10scfu/g。
[0017]可選的，所述菌劑的pH值為6.8-7.2。
[0018]本發(fā)明還提供了所述菌劑的制備方法，包括以下步驟:
[0019]將所述自生固氮菌MBC8接種于一級斜面培養(yǎng)基中，在28-30°C培養(yǎng)3_5天，獲得一級菌株；將所述一級菌株接種于二級液體培養(yǎng)基中，在28-30°C條件下震蕩培養(yǎng)2-3天，獲得二級菌株；將所述二級菌株接種于三級固體培養(yǎng)基中，在28-30°C條件下培養(yǎng)在1-2天后獲得三級菌株；將所述三級菌株與草炭按照(2.1 X 108-2.9X 108) cfu/g的配比混勻勻后獲得菌劑，優(yōu)選為2.9X 10scfu/g ;
[0020]其中，所述一級斜面培養(yǎng)基的配方為:KH2P040.2g/L，MgS04 0.2g/L，NaCl 0.2g，CaC03 5.0g，甘露醇 10.0g，CaS04 0.lg, pH 7.0，瓊脂 20g，蒸餾水 lOOOmL ；
[0021 ] 二級液體培養(yǎng)基的配方為:KH2P04 0.2g/L，MgS04 0.2g/L，NaCl 0.2g，CaC03
5.0g，甘露醇 10.0g，CaS04 0.lg, pH 7.0，蒸餾水 lOOOmL ；
[0022]三級固體培養(yǎng)基的配方為:甘露醇10.0g，酵母粉1.0g，MgS04.7H20 0.2g，K2HP04
0.5g，NaCl 0.lg, CaCl2 0.05g，Rh 微量元素液 4.0mL, H20 1000mL，瓊脂 20g，pH 6.8-7.0。
[0023]本發(fā)明還提供了所述自生固氮菌MBC8或所述的自生固氮菌劑在土壤改良中的應(yīng)用。
[0024]可選的，所述應(yīng)用包括將所述菌劑和砂土按質(zhì)量比1:9-11混合均勻后施用于土壤表面。
[0025]可選的，所述菌劑的用量為420_560g菌劑/畝。
[0026]發(fā)明提供了一種自生固氮細(xì)菌，通過乙炔還原法直接測得其固氮活性為21.38ηmol/yL-ho該菌株是從寧夏地區(qū)的荒漠生態(tài)系統(tǒng)環(huán)境提取的。該地區(qū)氣候干旱；全年以及晝夜溫差大(馮薇，2014) ; 土壤鹽堿災(zāi)害嚴(yán)重，紫外線非常強(qiáng)烈，尤其夏季紫外線強(qiáng)度高達(dá)到2(K)-533 μW/Cm2(蒲愛萍，et al.，2005)，輻射指數(shù)在8級左右。而一般情況下在輻射強(qiáng)度在70-130 μ W/cm2的紫外線下，輻射時間從15s到30min不等，殺菌率可達(dá)99%以上(李香云，et al., 2006,張鳳才and袁而森，1988，張福云and況凡，2005)。普通滅菌條件的紫外線強(qiáng)度和照射時均明顯低于寧夏夏季的紫外線強(qiáng)度。該菌株在干旱、大溫差、鹽堿災(zāi)害和強(qiáng)烈的紫外線輻射下依然能夠生存繁殖并具有固氮活性，尤其該細(xì)菌對紫外線的高度抗性是一般細(xì)菌所不具備的，在全球氣候變化臭氧空洞增加紫外線輻射日益強(qiáng)烈的今天來說，更加具有生態(tài)學(xué)意義和廣闊的應(yīng)用價值。其制成的菌劑能夠施用于干旱、高紫外線輻射的生態(tài)系統(tǒng)，并且能夠增加這些生態(tài)系統(tǒng)的氮素積累，可以起到改良土壤環(huán)境的作用，提高微生物和植物的生理活性，增加凈初級生產(chǎn)力。實驗表明，將該菌劑接種在寧夏西南緣無固氮活性的裸沙表面一年之后，其表層可以檢測到固氮活性，為161.58n mol并且有效氮也增加了由3.16mg kg1增加到了 14.lmg kg \簡單說，該菌株制成的菌劑有制作簡單、低成本、抗干旱、高紫外線抗性和固氮等優(yōu)點(diǎn)。
[0027]保藏信息:保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心ChinaGeneral Microb1logical Culture Collect1n Center(簡稱CGMCC，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101);保藏日期是2015年05月19日；該保藏中心登記入冊編號為CGMCC N0.10824 ;該保藏中心建議的分類命名是山羊豆根瘤菌Rhizobium galegae ;菌株編號為MBC8。
【具體實施方式】
[0028]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0029]實施例1
[0030]該菌株是從寧夏地區(qū)的荒漠生態(tài)系統(tǒng)表層提取的。該地區(qū)氣候干旱；全年和晝夜溫差大(馮薇，2014);紫外線非常強(qiáng)烈，尤其夏季紫外線強(qiáng)度高達(dá)到200-533 yW/Cm2(蒲愛萍，et al.，2005)，輻射指數(shù)在8級左右。而一般情況下在輻射強(qiáng)度在70-130 μ W/cm2的紫外線下，福射時間從15s到30min不等，殺菌率可達(dá)99%以上(李香云，et al., 2006,張鳳才and袁而森，1988，張福云and況凡，2005)。普通滅菌條件的紫外線強(qiáng)度和照射時均明顯低于寧夏夏季野外的紫外線強(qiáng)度，因而該菌株具有對紫外線具有高度抗性。
[0031]稱取表層土壤樣品10g并放入帶有玻璃珠的100mL的無菌水中靜置20min，在旋轉(zhuǎn)式搖床上200r/min充分振蕩30min，即成土壤懸液。用無菌移液管分別吸取5.0mL上述土壤懸液加入45mL無菌水中稀釋，用無菌移液管將菌懸液加至固體阿須貝培養(yǎng)基上，于28°C的條件下培養(yǎng)。以平板劃線法純化菌株。本發(fā)明所用的阿須貝培養(yǎng)基的配方為:KH2P04 0.2g/L，MgS04 0.2g/L，NaCl 0.2g，CaC03 5.0g，甘露醇 10.0g，CaS04 0.lg, pH 7.0，瓊脂