一株木質(zhì)纖維素類物質(zhì)高效降解菌m1及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株木質(zhì)纖維素類物質(zhì)高效降解菌Ml及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)業(yè)廢棄物產(chǎn)生量極其巨大，由于受經(jīng)濟(jì)效益和技術(shù)普及 的限制，農(nóng)業(yè)廢棄物大都粗放低效利用且閑置狀況嚴(yán)重，造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染，廢棄物 已經(jīng)成為中國最大的污染源。而在農(nóng)業(yè)廢棄物存在著大量的木質(zhì)纖維素，亟待人們?nèi)ラ_發(fā) 利用。
[0003] 木質(zhì)纖維素是自然界中僅次于纖維素的第二豐富的有機(jī)可再生資源，也是微生物 最難降解的成分之一。近年來，某些降解木質(zhì)素的真菌已開始在實(shí)際中得以應(yīng)用，但仍有待 進(jìn)一步開發(fā)。木質(zhì)素微生物降解的應(yīng)用主要有：造紙工業(yè)；飼料工業(yè)；發(fā)酵與食品工業(yè)；生 物物肥料環(huán)境保護(hù)；木素酶的生物漂白技術(shù)，等等。
[0004] 目前農(nóng)業(yè)有機(jī)固體廢棄通常通過能源化利用、有機(jī)肥料、禽畜飼料、可食用菌培養(yǎng) 基料和工業(yè)原料進(jìn)行利用。在利用農(nóng)業(yè)廢棄物的生產(chǎn)實(shí)踐中，物理、化學(xué)和生物處理方法 經(jīng)常結(jié)合使用，而其中生物處理方法尤其是利用微生物處理代表了今后的發(fā)展趨勢(shì)。生物 方法就是指利用木質(zhì)素降解酶去降解木質(zhì)纖維材料中的木質(zhì)素，從而使木質(zhì)素-半纖維 素-纖維素結(jié)構(gòu)解體，纖維素得以暴露出來供后續(xù)步驟處理與傳統(tǒng)的機(jī)械、物理化學(xué)類法 相比，生物處理法的優(yōu)點(diǎn)是能耗低，所需環(huán)境條件溫和，避免了傳統(tǒng)化學(xué)處理、機(jī)械處理技 術(shù)等耗能較多、存在環(huán)境污染等缺點(diǎn)，從成本和設(shè)備角度考慮，生物脫木質(zhì)素法占有獨(dú)特的 優(yōu)勢(shì)。但是，目前的生物處理法有一個(gè)很大的弱點(diǎn)限制了它的應(yīng)用，這就是生物處理法中的 關(guān)鍵角色-木質(zhì)素降解酶的活性普遍不高，從而導(dǎo)致處理效率較低，如果能利用基因工程 和傳統(tǒng)的生物技術(shù)對(duì)菌種和酶進(jìn)行改造，提高酶活力，降低酶成本，生物法脫木質(zhì)素法則有 望應(yīng)用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。
[0005] 而目前應(yīng)用最廣泛的是微生物菌肥，微生物菌肥作為一種新的農(nóng)業(yè)技術(shù)措施，在 發(fā)展高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效農(nóng)業(yè)中的作用逐漸被人們所認(rèn)識(shí)。傳統(tǒng)的微生物肥料己經(jīng)在大面積推 廣應(yīng)用中，新型的微生物菌肥品種不斷開發(fā)出來。微生物肥是由具有特殊效能的微生物經(jīng) 過發(fā)酵而制成的、含有大量有益微生物、對(duì)作物有特定肥效的特定微生物制品。微生物肥料 利用微生物的生命活動(dòng)，將作物不能吸收利用的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可被作物吸收利用的營養(yǎng)物， 改善作物的營養(yǎng)條件，有些兼有刺激作物生長或增強(qiáng)抗病性的作用，以提高作物產(chǎn)量，改善 農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)。它既能增加農(nóng)產(chǎn)品的出日創(chuàng)匯，又具有工農(nóng)業(yè)有機(jī)廢物有效利用、防止環(huán)境污 染、改進(jìn)土壤結(jié)構(gòu)、提高土壤肥力和保護(hù)生態(tài)良性循環(huán)的巨大社會(huì)效益和生態(tài)效益。
[0006] 國內(nèi)的研究大多數(shù)為真菌降解木質(zhì)纖維素。但是，利用真菌降解木質(zhì)纖維素普遍 存在酶活力較低的問題。由于克雷伯氏菌繁殖較快，發(fā)酵周期短，可應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，且克 雷伯氏菌產(chǎn)生的纖維素酶一般作用條件為中性或偏堿性，這在制漿、造紙和洗滌劑工業(yè)等 污染行業(yè)的廢水治理上有著潛在的應(yīng)用前景，因此從克雷伯氏菌中篩選出有效菌株應(yīng)用于 木質(zhì)纖維素降解具有一定的實(shí)際意義及開發(fā)前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是為了提供一株木質(zhì)素高效降解菌Ml及其應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的一株木質(zhì)素高效降解菌為肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae) M1，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北 辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2014年12月12日，保藏號(hào)CGMCC No. 10162。
[0009] 本發(fā)明的一株木質(zhì)素高效降解菌Ml用于降解木質(zhì)素上。
[0010] 本發(fā)明的有益效果如下：
[0011] 本發(fā)明的肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)Ml增值迅速，適應(yīng)性強(qiáng)，應(yīng)用 廣泛耐鹽性為NaCl濃度8%，耐熱性為70°C;連續(xù)傳代培養(yǎng)10次，菌株生長情況、產(chǎn)酶情況 以及酶活力穩(wěn)定，無退化現(xiàn)象；對(duì)袋料木耳廢料和玉米秸桿具有明顯的降解效果，經(jīng)肺炎克 雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)Ml發(fā)酵處理后的袋料木耳廢料的失重率在31%以上， 經(jīng)肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)Ml發(fā)酵處理后的玉米猜桿的失重率在30% 以上；具有顯著的木質(zhì)素降解能力，可以高效降解木質(zhì)素，經(jīng)復(fù)合微生物菌劑發(fā)酵處理的玉 米猜桿中木質(zhì)素含量是經(jīng)肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)Ml發(fā)酵處理的玉米猜 桿中木質(zhì)素含量的2倍，作為單一菌株肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)Ml對(duì)木 質(zhì)素的降解能力強(qiáng)于復(fù)合微生物菌劑；在降解樣品時(shí)，不影響樣品中的主要元素含量，不會(huì) 導(dǎo)致試樣中的全氮、全磷、全鉀、速效磷和速效鉀含量變化，保存樣品肥效。
[0012] 本發(fā)明從袋料木耳廢料、林間朽木和林間土壤中分離篩選出能夠以木質(zhì)素為唯一 碳源生長的原始菌株，確定對(duì)木質(zhì)素的降解能力以及種屬關(guān)系，為將來復(fù)合微生物菌劑構(gòu) 建奠定基礎(chǔ)。將為我國農(nóng)業(yè)資源的有效化利用提供有力幫助。
【附圖說明】
[0013] 圖1為本發(fā)明肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)Ml培養(yǎng)12h后的掃描電 子顯微鏡圖（X20, 000);
[0014] 圖2為16S rDNA序列PCR擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖其中，1泳道為Maker DL2000,2泳道為菌株Ml ;
[0015] 圖3為回收后的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖其中，1泳道為Maker DL2000, 2 泳道為菌株Ml ;
[0016] 圖4為陽性克隆子篩選的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖其中，1泳道為Maker DL2000, 2 泳道為菌株Ml ;
[0017] 圖5為本發(fā)明肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)Ml的系統(tǒng)進(jìn)化樹；
[0018] 圖6為本發(fā)明肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)Ml對(duì)袋料木耳廢料的失 重率圖；
[0019] 圖7為本發(fā)明肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)Ml對(duì)玉米猜桿的失重率 圖；
[0020] 圖8為本發(fā)明肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)Ml菌株降解后玉米猜桿 中各組分含量柱狀圖；其中，1為木質(zhì)素含量柱狀圖；2為纖維素含量柱狀圖；3為半纖維素 含量柱狀圖；
[0021] 圖9為本發(fā)明肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)Ml菌株發(fā)酵處理后玉米 秸桿中全氮全磷和全鉀含量柱狀圖；其中，1為全氮含量柱狀圖；2為全磷含量柱狀圖；3為 全鉀含量柱狀圖；
[0022] 圖10為本發(fā)明肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)Ml菌株發(fā)酵處理后玉 米猜桿中速效磷含量柱狀圖；
[0023] 圖11為本發(fā)明肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)Ml菌株發(fā)酵處理后玉 米猜桿中速效鉀含量柱狀圖。
【具體實(shí)施方式】
【具體實(shí)施方式】 [0024] 一：本實(shí)施方式的一株木質(zhì)纖維素類物質(zhì)高效降解菌M1，它為肺炎 克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)Ml，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微 生物中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2014年12月12日， 保藏號(hào) CGMCC No. 10162。
[0025] 本實(shí)施方式的肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)Ml為革蘭氏陰性菌，該 菌株菌體形態(tài)為桿狀，菌體大小為0. 62~0. 71 X 1. 5~1. 6 μ m，不形成芽孢，無鞭毛，有莢 膜，；在LB培養(yǎng)基上形成圓形、不透明、黃色、突起光滑、邊緣整齊的菌落（如圖1所示）。
[0026] 該菌株的生理生化反應(yīng)結(jié)果共20項(xiàng)、30個(gè)指標(biāo)；結(jié)合形態(tài)與生理生化反應(yīng)結(jié)果， 比對(duì)《伯杰氏克雷伯氏菌鑒定手冊(cè)》確定該菌株的種屬，結(jié)果如表1所示。
[0027] 根據(jù)《常見克雷伯氏菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰克雷伯氏菌手冊(cè)》對(duì)分離出的克雷 伯氏菌（Klebsiella sp.)Ml進(jìn)行進(jìn)行革蘭氏染色、氧化酶、接觸酶、熒光色素、甲基紅、七葉 苷溶解、明膠液化、石蕊牛乳胨化及產(chǎn)酸、脂酶、淀粉水解、V. P.測(cè)定、檸檬酸鹽利用、纖維素 降解、3-酮基乳糖利用、苯丙氨酸脫氨酶、色氨酸脫氨酶、耐熱熱性、耐鹽性生理生化實(shí)驗(yàn)的 檢測(cè)和鑒定。結(jié)果表明克雷伯氏菌（Klebsiella sp.)Ml為革蘭氏陰性菌，耐鹽性為NaCl 濃度8%，耐熱性為70°C，可產(chǎn)生接觸酶、脲酶和色氨酸脫氨酶，但不能產(chǎn)生氧化酶、脂酶、 苯丙氨酸脫氨酶和熒光色素，甲基紅、檸檬酸鹽利用、淀粉水解、明膠液化、糖醇發(fā)酵（甘 露糖）、七葉苷溶解和石蕊牛乳產(chǎn)酸表現(xiàn)為陽性，V. P.試驗(yàn)、石蕊牛乳胨化、纖維素降解和 3_酮基乳糖利用表現(xiàn)為陰性。
[0028] 表1菌株Ml的形態(tài)學(xué)特征與生理生化鑒定結(jié)果
[0029]
[0031] 本實(shí)施方式的木質(zhì)素高效降解菌為肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)Ml 的篩選方法如下：
[0032] 1、篩選方法
[0033] 取IOg樣品在無菌條件下充分研磨，加入裝有90mL無菌水（帶玻璃珠）的三角瓶 中，振蕩20min。取5mL樣品懸液接入裝有IOOmL液體LB培養(yǎng)基的三角瓶中，37°C，180r/ min振蕩培養(yǎng)8h ;將菌液分別制成稀釋度為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的樣液，各取 200 μ L涂于木質(zhì)素篩選培養(yǎng)基平板，37°C恒溫培養(yǎng)48h，根據(jù)菌落生長情況調(diào)整稀釋梯度。 保持培養(yǎng)