一種nkt細(xì)胞的培養(yǎng)方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其涉及一種NKT細(xì)胞的培養(yǎng)方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 自體免疫細(xì)胞療法是腫瘤生物治療的重要方法之一。自體免疫細(xì)胞療法是將從自 體外周血中分離出單個核細(xì)胞，在多種免疫活性因子的作用下，通過體外培養(yǎng)，有效活化和 擴(kuò)增為免疫活性細(xì)胞，包括NK細(xì)胞、CIK細(xì)胞和NKT (naturalkiIlerT)細(xì)胞等，再輸入患者 體內(nèi)，使免疫細(xì)胞直接殺傷腫瘤細(xì)胞或病毒感染細(xì)胞，或調(diào)節(jié)和增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能的治 療方法
[0003] NKT細(xì)胞是人外周血單個核細(xì)胞在體外經(jīng)IL-2等多種細(xì)胞因子刺激后，獲得的以 表達(dá)CD3+CD6 +標(biāo)志為主的免疫效應(yīng)細(xì)胞，具有T淋巴細(xì)胞的殺瘤活性，為新一代殺傷效應(yīng)細(xì) 胞。NKT細(xì)胞的主要特征為T細(xì)胞受體（TCR)基因表達(dá)的恒定性、CDld的限制性以及細(xì)胞 因子產(chǎn)生的迅速、高水平性。NKT細(xì)胞既能增強(qiáng)免疫反應(yīng)又能抑制免疫反應(yīng)，從而在抗腫瘤、 抗感染、抑制自身免疫性疾病及移植耐受中發(fā)揮重要作用。NKT細(xì)胞雖也以⑶3 +⑶6+標(biāo)志 的細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，但是和CIK細(xì)胞的不同，NKT來源于外周血中CD4 CD8標(biāo)志的細(xì)胞。
[0004] 目前NKT細(xì)胞的制備方法一般是直接分離外周血中的單個核細(xì)胞（PBMC)，然后將 PBMC在含有一定濃度的IL-2、IL-15的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周得到NKT細(xì)胞。但現(xiàn)有技術(shù)中培 養(yǎng)得到的NKT細(xì)胞殺傷活性較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，有必要針對現(xiàn)有技術(shù)中NKT細(xì)胞殺傷活性低的問題，提供一種NKT細(xì)胞 的培養(yǎng)方法和用途。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0007] -種NKT細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括將巨噬細(xì)胞與NKT細(xì)胞共培養(yǎng)的步驟。
[0008] 優(yōu)選地，所述NKT細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0009] Sl、細(xì)胞的分選：
[0010] 自PBMC中分選出單核細(xì)胞；
[0011] S2、巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)：
[0012] 將步驟Sl分選得到的單核細(xì)胞誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞；
[0013] S3、NKT細(xì)胞的誘導(dǎo)：
[0014] 將步驟Sl分選剩余的細(xì)胞誘導(dǎo)為NKT細(xì)胞；
[0015] S4、巨噬細(xì)胞和NKT細(xì)胞共培養(yǎng)：
[0016] 將S2獲得的巨噬細(xì)胞和S3獲得的NKT細(xì)胞共培養(yǎng)7-8天。
[0017] 優(yōu)選地，所述步驟S2中使用腫瘤細(xì)胞裂解液上清刺激巨噬細(xì)胞。
[0018] 優(yōu)選地，所述步驟S2中巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)具體方法為：用巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng) 單核細(xì)胞，培養(yǎng)至第4天加入腫瘤細(xì)胞裂解液上清，培養(yǎng)至第6天收集巨噬細(xì)胞；所述巨噬 細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成為：500-1000U/mL GM-CSF(粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞集落刺激因子）、體 積分?jǐn)?shù)3-10%自體血漿、余量為X-VIVO 15無血清培養(yǎng)基。
[0019] 優(yōu)選地，所述腫瘤細(xì)胞裂解液上清中蛋白終濃度為1-10 μ g/mL，優(yōu)選5 μ g/mL。腫 瘤細(xì)胞裂解液上清可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增殖和成熟，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的識別作用 和殺傷活性。所述腫瘤細(xì)胞裂解液通過反復(fù)凍融方法制備。
[0020] 優(yōu)選地，所述步驟S3中NKT細(xì)胞的誘導(dǎo)具體方法為：用NKT細(xì)胞用培養(yǎng)基培養(yǎng)步 驟Sl分選后剩余的細(xì)胞，培養(yǎng)至第6天收集NKT細(xì)胞；所述NKT細(xì)胞用培養(yǎng)基的組成為： 100-500U/mL IL-2 (白細(xì)胞介素-2)、10-100 μ g/mL IL-15 (白細(xì)胞介素-15)、10-100 μ g/ mL IL-21(白細(xì)胞介素-21)、余量為X-VIVO 15無血清培養(yǎng)基。
[0021 ] 優(yōu)選地，所述步驟S4中巨噬細(xì)胞和NKT細(xì)胞共培養(yǎng)具體方法為：將S2獲得的巨噬 細(xì)胞和S3獲得的NKT細(xì)胞用NKT細(xì)胞用培養(yǎng)基共同培養(yǎng)7-8天。
[0022] 優(yōu)選地，步驟S2-S4中的培養(yǎng)條件為37°C、5% C02。
[0023] 優(yōu)選地，所述步驟S2-S4在培養(yǎng)過程中按照I X 106cells/mL的細(xì)胞密度補(bǔ)加培養(yǎng) 液和細(xì)胞因子。
[0024] 優(yōu)選地，巨噬細(xì)胞與NKT細(xì)胞按數(shù)量比1:10-25共培養(yǎng)。
[0025] 更優(yōu)選地，巨噬細(xì)胞與NKT細(xì)胞按數(shù)量比1:15-20共培養(yǎng)。
[0026] 更進(jìn)一步優(yōu)選地，巨噬細(xì)胞與NKT細(xì)胞按數(shù)量比1:20共培養(yǎng)。
[0027] 本發(fā)明還提供巨噬細(xì)胞的用途，巨噬細(xì)胞用于增強(qiáng)NKT細(xì)胞殺傷活性的用途。
[0028] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)方法有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0029] 本發(fā)明將單核細(xì)胞從單個核細(xì)胞中分選出來，然后采用一定濃度的GM-CSF對單 核細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，使之成為巨噬細(xì)胞。PBMC分選出單核細(xì)胞后的剩余細(xì)胞為懸浮細(xì)胞，將懸 浮細(xì)胞培養(yǎng)成NKT細(xì)胞，之后將巨噬細(xì)胞和NKT細(xì)胞二者共培養(yǎng)。巨噬細(xì)胞可以直接吞噬 細(xì)胞，同時(shí)也具有一定的抗原提呈功能，故將巨噬細(xì)胞與NKT細(xì)胞共培養(yǎng)，直接提高了 NKT 細(xì)胞的殺傷活性。
[0030] 本發(fā)明采用特異性的腫瘤細(xì)胞裂解液上清對巨噬細(xì)胞進(jìn)行刺激，得到的巨噬細(xì)胞 抗原提呈能力更強(qiáng)。如NKT細(xì)胞對K562細(xì)胞進(jìn)行殺傷時(shí)，在培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的時(shí)候，采用K562 細(xì)胞裂解液上清對巨噬細(xì)胞進(jìn)行刺激。NKT細(xì)胞對HL60細(xì)胞進(jìn)行殺傷時(shí)，在培養(yǎng)巨噬細(xì)胞 的時(shí)候，采用HL60細(xì)胞裂解液上清對巨噬細(xì)胞進(jìn)行刺激。
【附圖說明】
[0031 ] 圖1為本發(fā)明NKT細(xì)胞的培養(yǎng)方法的流程圖。
[0032] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中細(xì)胞形態(tài)圖。其中，圖2A和圖2B分別為NKT細(xì)胞誘導(dǎo) 第1天、第6天的形態(tài)，圖2C和圖2D分別為NKT細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)第1天、第7天的 形態(tài)。
[0033] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中獲得的巨噬細(xì)胞的流式檢測結(jié)果圖。
[0034] 圖4為本發(fā)明效果實(shí)施例1中流式檢測結(jié)果圖。其中圖4A和圖4B為采用實(shí)施例 1方法獲得的NKT細(xì)胞，圖4C和圖4D為采用對比例1方法獲得的NKT細(xì)胞。
[0035] 圖5為效果實(shí)施例3中增殖曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 為了更好的說明本發(fā)明，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例做進(jìn)一步說明。本發(fā)明中 K562細(xì)胞（人白血病細(xì)胞）、HL60細(xì)胞（人原髓細(xì)胞白血病細(xì)胞）和H印G2細(xì)胞（人肝癌 細(xì)胞）由暨南大學(xué)生物醫(yī)藥研究基地惠贈，所用試劑或儀器均可由市場購得，使用的檢測 方法等都是本領(lǐng)域所熟知的，在此不再贅述。
[0037] 實(shí)施例1、NKT細(xì)胞的培養(yǎng)方法
[0038] -種NKT細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0039] Sl、細(xì)胞的分選：用⑶14分選試劑盒（購自STEM CELL公司）自PBMC懸液中分選 出單核細(xì)胞（CD14+細(xì)胞），剩余細(xì)胞為懸浮細(xì)胞（CD14細(xì)胞）。
[0040] S2、巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)：用巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸單核細(xì)胞，按照 I X 106-2X IO6ceIlsAiL的密度接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，用巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基于37°C、5 % CO2條件下培養(yǎng)，定期進(jìn)行觀察，每隔2-3天按照I X 10 6CellsAiL的細(xì)胞密度補(bǔ)加培養(yǎng)液和 細(xì)胞因子。培養(yǎng)第4天加入蛋白終濃度5 μ g/mL的K562細(xì)胞裂解液上清進(jìn)行刺激，第5天 收集部分細(xì)胞進(jìn)行流式鑒定，第6天收集巨噬細(xì)胞。所述巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成為： 500U/mL GM-CSF、體積分?jǐn)?shù)5%自體血漿，余量為X-VIVO 15無血清培養(yǎng)基。
[0041] S3、NKT細(xì)胞的誘導(dǎo)：用NKT細(xì)胞用培養(yǎng)基重懸懸浮細(xì)胞，按照 I X 106-2X Kfcells/mL的密度接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，用NKT細(xì)胞用培養(yǎng)基在37°C、5% CO2 條件下培養(yǎng)。定期在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的狀態(tài)，每隔1-2天按照I X Kfcells/mL的細(xì) 胞密度補(bǔ)加培養(yǎng)液和細(xì)胞因子。第6天收集NKT細(xì)胞。所述NKT細(xì)胞用培養(yǎng)基的組成為： lOOU/mL IL-2、50yg/mL IL-15、100yg/mL IL-21，余量為 X-VIVO 15 無血清培養(yǎng)基。
[0042] S4、巨噬細(xì)胞和NKT細(xì)胞共培養(yǎng)：將第6天收集的巨噬細(xì)胞和NKT細(xì)胞按照1:10 的數(shù)量比，以I X 1〇6_2 X 106cells/mL的密度接種，用NKT細(xì)胞用培養(yǎng)基共培養(yǎng)，培養(yǎng)至第14 天（共培養(yǎng)8天）收集細(xì)胞共培養(yǎng)物。
[0043] NKT細(xì)胞形態(tài)及共培養(yǎng)時(shí)兩種細(xì)胞的形態(tài)如圖2所示。圖2A和圖2B分別為NKT 細(xì)胞誘導(dǎo)第1天、第6天的形態(tài)；NKT細(xì)胞誘導(dǎo)第1天，細(xì)胞較少，體積較小，培養(yǎng)至第6天 時(shí)，細(xì)胞數(shù)增多，體積變大，核質(zhì)比更加明顯。圖2C和圖2D分別為NKT細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共 培養(yǎng)第1天、第7天的形態(tài)；與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，NKT細(xì)胞增殖更快，細(xì)胞體積更大。巨噬 細(xì)胞的流式檢測結(jié)果如圖3所示，由圖3A和圖3B可知，巨噬細(xì)胞的⑶14⑶Ilb +的比例為 98. 7%，說明本實(shí)施例中獲得的巨噬細(xì)胞的純度非常高。
[0044] 使用的自體血漿、PBMC可以通過常規(guī)方法制備。本發(fā)明中制備PBMC的具體方法 如下：
[0045] 將抗凝管中的外周血轉(zhuǎn)移到離心管中，400-500g離心5-10min，離心結(jié)束后將上 層血漿收集于另一支離心管中，在56°C的水浴鍋中進(jìn)行熱滅活，然后用0. 22 μ M的一次性 濾器過濾，標(biāo)記后置于4°C冰箱，備用。
[0046] 將下層血細(xì)胞轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，加入兩倍體積的生理鹽水進(jìn)行稀釋。另取一 支新的s印mate離心管（購自STEM CELL公司），加入Ficoll淋巴細(xì)胞分離液（購自STEM CELL公司）12mL，將稀釋后的血細(xì)胞轉(zhuǎn)移到sepmate離心管，600_800g離心15_20min。離 心后，將上層液體倒出，加入生理鹽水進(jìn)行洗