Dc誘導(dǎo)活化劑、dc體外培養(yǎng)方法和dc、及cik的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞免疫技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種DC誘導(dǎo)活化劑、DC體外培養(yǎng)方法和DC、及 CIK。
【背景技術(shù)】
[0002]過(guò)繼免疫治療是將自身或異體的抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞的前體細(xì)胞，在體外采用IL-2、抗CD3單抗，特異性多肽等激活劑進(jìn)行誘導(dǎo)、激活和擴(kuò)增后，再轉(zhuǎn)輸給腫瘤患者，從而提高患者抗腫瘤免疫力，以達(dá)到治療的目的。目前在臨床中使用最多的過(guò)繼細(xì)胞免疫治療主要是 DC(dendritic cell，樹(shù)突狀細(xì)胞)治療、CIK (Cytokine-1nduced Killer，細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞)治療和DC-CIK聯(lián)合免疫治療。其中，DC主要從骨髓組織、血液中分離出，具有很強(qiáng)的捕獲抗原、呈遞抗原的能力和分泌能力，能夠誘導(dǎo)持久有力的特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)。CIK是人外周血中單個(gè)核細(xì)胞在體外經(jīng)多種細(xì)胞因子刺激后獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞。它具有增殖能力強(qiáng)、殺瘤活性高和殺瘤譜廣、臨床應(yīng)用不良反應(yīng)小的特點(diǎn)，是腫瘤過(guò)繼免疫治療中更為有效的殺瘤效應(yīng)細(xì)胞。而相對(duì)前兩者，將DC和CIK進(jìn)行共培養(yǎng)之后形成的DC-CIK聯(lián)合免疫具有更優(yōu)的使用效果，因?yàn)樵诠才囵B(yǎng)的過(guò)程中，兩者之間相互既促進(jìn)DC的成熟，更能促進(jìn)C1K的增殖并且加強(qiáng)CIK的腫瘤殺傷效力。
[0003]然而現(xiàn)有技術(shù)通常的DC體外增殖和誘導(dǎo)過(guò)程中，由于DC本身分離自單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)體外培養(yǎng)中的半貼壁細(xì)胞，這些貼壁細(xì)胞直接貼附在加工處理的塑料培養(yǎng)容器中，而這一體外的培養(yǎng)環(huán)境不能具備體內(nèi)的原始生存環(huán)境，因此DC的生長(zhǎng)、成熟以及表達(dá)的性狀、免疫活性等方面都不能達(dá)到原始體內(nèi)環(huán)境的水平，大大影響了 DC所要具備的抗原提呈效果。
[0004]而進(jìn)一步在DC-CIK聯(lián)合免疫中，由于CIK功能的強(qiáng)弱與DC提呈的專一性和數(shù)量有關(guān)，將培養(yǎng)的DC與CIK進(jìn)行共培養(yǎng)時(shí)，DC體外增殖能力低、相反CIK增殖能力強(qiáng)大，會(huì)造成DC和CIK的接觸機(jī)會(huì)低，從而影響DC的抗原提呈作用，最終降低CIK的治療效力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明實(shí)施的目的在于克服現(xiàn)有培養(yǎng)出DC抗原提呈性能以及與CIK共培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)能力不足影響CIK殺傷力的缺陷，提供一種能夠在DC進(jìn)行體外培養(yǎng)的過(guò)程中大大提升其抗原提呈能效、細(xì)胞活性，但同時(shí)又能保持其分化程度的DC誘導(dǎo)活化劑，以及采用該DC誘導(dǎo)活化劑進(jìn)行DC體外培養(yǎng)的方法和方法得到的DC、CIKo
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案如下:
[0007]—種DC誘導(dǎo)活化劑，包括小細(xì)胞肺癌特異性EGFR和鋁佐劑。
[0008]本發(fā)明的上述DC誘導(dǎo)劑利用EGFR本身具有很多腫瘤細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)簇，在DC進(jìn)行培養(yǎng)的過(guò)程中作為模擬抗原對(duì)DC進(jìn)行刺激和誘導(dǎo)，使其細(xì)胞活性能維持在較高的狀態(tài)；同時(shí)搭配鋁佐劑形成EGFR緩釋，以及保護(hù)EGFR降解、衰減，還與DC質(zhì)膜相互作用，最終能強(qiáng)化DC對(duì)抗原的處理和提呈能力。
[0009]本發(fā)明在上述DC誘導(dǎo)活化劑的基礎(chǔ)上還提出一種采用上述DC誘導(dǎo)活化劑進(jìn)行DC體外培養(yǎng)的方法，包括如下步驟:
[0010]獲取DC，對(duì)所述DC進(jìn)行體外培養(yǎng)；
[0011 ] 在所述體外培養(yǎng)的過(guò)程中，用上述DC誘導(dǎo)活化劑對(duì)所述DC進(jìn)行誘導(dǎo)處理。
[0012]本發(fā)明的上述DC體外培養(yǎng)的方法，為了克服免疫細(xì)胞治療存在的單核貼壁細(xì)胞貼壁環(huán)境不佳、DC提呈效果不強(qiáng)、活性抗原不易儲(chǔ)存的現(xiàn)象，添加小細(xì)胞肺癌特異性抗原EGFR和鋁鹽佐劑進(jìn)行誘導(dǎo)和活化，相比現(xiàn)有方式培養(yǎng)的DC具有更高的對(duì)抗原的處理和提呈能力和更強(qiáng)大的腫瘤特異性殺傷細(xì)胞。
[0013]本發(fā)明還提出一種采用上述DC體外培養(yǎng)的方法培養(yǎng)得到的DC，以及將該DC應(yīng)用于DC-CIK聯(lián)合免疫，進(jìn)行DC-CIK共培養(yǎng)制備的CIK。
[0014]本發(fā)明制備得到的DC和CIK相比現(xiàn)有的通常培養(yǎng)的方式制備的DC和CIK，DC活性和增值能力高，在共培養(yǎng)的過(guò)程中能具有與CIK更多的接觸幾率；并且在培養(yǎng)的過(guò)程中，DC經(jīng)過(guò)EGFR的誘導(dǎo)，能提呈更多的抗原信息，使得最終制備得到的CIK具有更高的活性和腫瘤特異性殺傷能力。
【具體實(shí)施方式】
[0015]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0016]本發(fā)明實(shí)例提出一種用于DC體外培養(yǎng)過(guò)程中提升DC對(duì)抗原的處理和提呈能力的DC誘導(dǎo)活化劑，該DC誘導(dǎo)活化劑能夠在DC進(jìn)行體外培養(yǎng)的過(guò)程中大大提升其抗原提呈能效、細(xì)胞活性，但同時(shí)又能保持其分化程度。本發(fā)明的DC誘導(dǎo)活化劑包括小細(xì)胞肺癌(Small Cell Lung Cancer，SCLC)特異性EGFR (epidermal growth factor receptor，表皮生長(zhǎng)因子受體)和鋁佐劑的混合物。
[0017]其中，EGFR本身是上皮生長(zhǎng)因子細(xì)胞增殖和信號(hào)傳導(dǎo)的受體，是一種糖蛋白，屬于酪氨酸激酶型受體，EGFR在實(shí)體腫瘤中會(huì)存在高表達(dá)或異常表達(dá)，而EGFR的過(guò)表達(dá)或者異常表達(dá)是和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵潤(rùn)、預(yù)后差有關(guān)。因此在本發(fā)明中采用小細(xì)胞肺癌特異性EGFR，利用其本身具有很多腫瘤細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)簇，在DC進(jìn)行培養(yǎng)的過(guò)程中作為模擬抗原對(duì)DC進(jìn)行刺激和誘導(dǎo)，使其細(xì)胞活性能維持在較高的狀態(tài)。同時(shí)，EGFR相比通常使用的人工合成和直接通過(guò)患者腫瘤切除組織的特意性抗原，除了結(jié)構(gòu)簇豐富、效果好之外；更主要的是在體外液體培養(yǎng)環(huán)境或者存儲(chǔ)過(guò)程中，人工合成和直接通過(guò)患者腫瘤切除組織抗原特性會(huì)逐漸的減弱，需要較嚴(yán)格的存儲(chǔ)或者使用環(huán)境以保證其特效，而EGFR自身是糖蛋白，在胞內(nèi)成熟之后，其形態(tài)結(jié)構(gòu)不容易再發(fā)生較大的變化，抗原穩(wěn)定性和存儲(chǔ)便易度都更好。
[0018]針對(duì)DC培養(yǎng)中的液相培養(yǎng)的環(huán)境和過(guò)程結(jié)合上述EGFR，DC誘導(dǎo)活化劑進(jìn)一步還包括有鋁佐劑，其是一種優(yōu)良的呈半膠狀的蛋白吸附劑，能從溶液中強(qiáng)烈吸附蛋白質(zhì)抗原，形成非變性的物理沉淀；當(dāng)其接種到類似機(jī)體環(huán)境內(nèi)后可形成一個(gè)“抗原庫(kù)”，緩慢釋放出抗原，充分延長(zhǎng)了 EGFR的作用時(shí)間；并且更進(jìn)一步還能對(duì)EGFR進(jìn)行保護(hù)，避免EGFR在環(huán)境變化中發(fā)生自身結(jié)構(gòu)或者性能變化、降解等等而導(dǎo)致抗原特性衰減的情形。同時(shí)，除了上述保護(hù)作用之外，鋁佐劑自身也可以通過(guò)與DC質(zhì)膜相互作用，提升DC的細(xì)胞活性，具有免疫佐劑功能；因此本發(fā)明的DC誘導(dǎo)活化劑最終能強(qiáng)化DC對(duì)抗原的處理和提呈能力，獲得更強(qiáng)大的腫瘤特異性殺傷細(xì)胞。
[0019]在上述實(shí)施方式中，鋁佐劑根據(jù)使用情況可以選擇氫氧化鋁、氫氧化鋁凝膠、磷酸鋁、硫酸鋁、銨明礬及鉀明礬中的至少一種。在實(shí)施中，基于其用于結(jié)合蛋白共同發(fā)揮效果的目的，一般根據(jù)用于蛋白質(zhì)作為的溶劑和保護(hù)的PBS緩沖系，鋁佐劑優(yōu)選采用磷酸鋁進(jìn)行，可以盡量地避免額外引入其他的元素或者離子、基團(tuán)等對(duì)培養(yǎng)過(guò)程中的培養(yǎng)液元素比例和成分造成破壞。進(jìn)一步在使用中，根據(jù)鋁佐劑吸附能力，DC誘導(dǎo)活化劑中小細(xì)胞肺癌特異性EGFR和鋁佐劑的質(zhì)量比控制在2:1?8:1。
[0020]在本發(fā)明提出的上述DC誘導(dǎo)活化劑的基礎(chǔ)上，本發(fā)明進(jìn)一步還提出一種DC體外培養(yǎng)的方法，包括如下步驟:
[0021]S10，從單個(gè)核細(xì)胞中獲取DC ;
[0022]S20，將獲取的DC進(jìn)行體外培養(yǎng)；
[0023]S30，在體外培養(yǎng)的過(guò)程中用上述DC誘導(dǎo)活化劑對(duì)DC進(jìn)行活化誘導(dǎo)。
[0024]其中，步驟S10中制備獲取DC，在本發(fā)明實(shí)施中優(yōu)選建議采用從新鮮血液中獲取，相比經(jīng)過(guò)冷庫(kù)儲(chǔ)存或者培養(yǎng)傳代之后的DC，從新鮮血液中制備的DC離體時(shí)間不長(zhǎng)，其細(xì)胞活性和狀態(tài)的減弱或者形態(tài)改變程度都較少，更加利于保持其免疫性能。具體制備的過(guò)程可以按照通常DC制備試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行制備獲取，而在本發(fā)明中為了更適于本發(fā)明的誘導(dǎo)的效果和細(xì)胞活性，可以參考如下過(guò)程進(jìn)行:
[0025]S11，獲取新鮮血液(為了防止血液凝固，可以先用抗凝劑進(jìn)行抗凝處理)；
[0026]S12，將血液300g離心分離后棄去血漿，取細(xì)胞沉淀物備用；
[0027]S13，用淋巴細(xì)胞分離液分離提取細(xì)胞沉淀物中的單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)；
[0028]S14，將步驟S13獲取的單個(gè)核細(xì)胞用基礎(chǔ)培養(yǎng)