一種新型抗原群的h9n2禽流感病毒及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種禽流感病毒，具體來(lái)說是一種新型抗原群的 H9N2禽流感病毒及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] H9N2亞型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV)自上個(gè)世紀(jì)90年代以來(lái)已 經(jīng)廣泛在我國(guó)和世界各地流行，不僅僅給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且給公共衛(wèi)生 安全造成的隱患不可估量，對(duì)人類的健康也構(gòu)成了巨大的威脅。在我國(guó)，獨(dú)特的地理環(huán)境及 養(yǎng)殖模式為此病的發(fā)生、傳播提供了有利條件。而免疫壓力及活禽市場(chǎng)的存在又為H9N2亞 型禽流感病毒的重組和變異提供了必要條件。目前，H9N2亞型的疫苗已用于常規(guī)免疫，在 一定程度上控制了 H9N2亞型AIV的暴發(fā)流行。但是，由于禽流感病毒具有傳播快、感染宿 主具有多樣性，病毒株血清型眾多、不同毒株間毒力差異大、變異性強(qiáng)等特點(diǎn)，造成局部地 區(qū)仍有流行，且非典型性流行增多，免疫失敗也屢見不鮮。Radu等及Kilbourne等指出疫 苗株應(yīng)經(jīng)常改變，因?yàn)槔系囊呙缰晖ǔH對(duì)新毒株產(chǎn)生部分的保護(hù)力。1999年，Garcia等 證實(shí)禽流感暴發(fā)期間AIV分離株有很高的變異性，從而導(dǎo)致疫苗無(wú)效。Suarez等認(rèn)為，AIV 的變異可引起禽類甚至人類疫苗免疫的失敗。劉紅旗等研究指出，HA基因的變異可能與頻 繁的疫苗免疫選擇壓力有關(guān)。本試驗(yàn)擬通過HI交叉試驗(yàn)來(lái)比較分析2002年，2006-2014年 上海地區(qū)分離的H9N2亞型禽流感病毒之間的抗原相關(guān)性，探討其抗原性是否發(fā)生漂移，為 H9N2亞型禽流感的防制提供參考依據(jù)。為了 了解不同年份分離的H9N2亞型禽流感病毒與 目前使用的疫苗株CK/SH/F/98之間的抗原相關(guān)性，挑選2002年，2006-2014年間在上海地 區(qū)分離的14株H9N2亞型禽流感病毒以及CK/SH/F/98病毒，通過HI交叉試驗(yàn)進(jìn)行抗原性比 較和分析。HI試驗(yàn)結(jié)果顯示：2002年，2006-2014年間在上海地區(qū)流行的H9N2亞型不同毒 株間已經(jīng)發(fā)生了抗原性的漂移，劃分成4個(gè)不同的抗原群，A/chicken/Shanghai/Yl/2002， A/chicken/Shanghai/Yl/2006 和 A/duck/Shanghai/C60/2007 同屬于一個(gè)抗原群，命名為 A 群；A/chicken/Shanghai /C/2011 獨(dú)自成為一個(gè)抗原群，命名為B群；A/pigeon/Shanghai/ JC1/2013和A/chicken/Shanghai/1107/2013歸為同一個(gè)抗原群，命名為D群；其余毒株均 為一個(gè)抗原群，命名為C群。從抗原性聚類分析發(fā)現(xiàn)14株病毒均從CK/SH/F/98演化而來(lái)。 綜上所述，整體來(lái)看一方面H9N2病毒是隨時(shí)間的增長(zhǎng)，抗原發(fā)生了不同程度的漂變，但是 也存在在某個(gè)時(shí)間段，多種抗原群共存的情況。該研究結(jié)果從理論上為我市制定禽流感防 控策略、有效防制H9N2流行提供了科學(xué)的指導(dǎo)，為生產(chǎn)上H9N2亞型流感免疫與制苗毒株的 選擇提供參考依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種新型抗原群的H9N2禽流感 病毒及其用途，所述的這種新型抗原群的H9N2禽流感病毒及其用途解決了現(xiàn)有技術(shù)中無(wú) 法預(yù)防新的禽流感病毒從而導(dǎo)致新的禽流感疫情在禽類或者人類傳播的技術(shù)問題。
[0004] 本發(fā)明提供了一種分離的H9N2禽流感病毒（抗原群D群），其基因組由SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO :8所示的RNA片段組成。
[0005] 本發(fā)明還提供了一種分離的H9N2禽流感病毒，其保藏號(hào)為CGMCC NO :10925。
[0006] 本發(fā)明還提供了一種用于預(yù)防上述的H9N2禽流感病毒的疫苗，含有滅活的上述 的H9N2禽流感病毒。
[0007] 本發(fā)明還提供了上述的用于預(yù)防H9N2禽流感病毒的疫苗的制備方法，包括如下 步驟：
[0008] a)，一個(gè)疫苗抗原液制備及毒價(jià)測(cè)定的步驟，將權(quán)利要求1或2所述的H9N2 禽流感病毒用滅菌生理鹽水稀釋后，接種非免疫雞胚，收取尿囊液，測(cè)定其毒價(jià)：在 l(f6-l(fsEID50, HA價(jià)在I :256-512之間，病毒液置冰箱中保存?zhèn)溆茫?br>[0009] b)，一個(gè)抗原液滅活的步驟，將福爾馬林溶液加入病毒液中，檢驗(yàn)合格后作為制備 抗原液；
[0010] c)，一個(gè)制備油相佐劑的步驟；
[0011] d)，一個(gè)制備疫苗水相的步驟；
[0012] e)，一個(gè)配制疫苗的步驟，將油相與水相預(yù)混后，再將混合物注入到高壓勻漿栗內(nèi) 乳化，制成油包水乳劑即為疫苗。
[0013] 進(jìn)一步的，所述的油相佐劑由白油、司本-80和硬脂酸鋁配制混合而成。
[0014] 進(jìn)一步的，在制備疫苗水相的步驟中，將吐溫-80經(jīng)高溫滅菌后，加入到己滅活抗 原液中，吐溫-80的終濃度在2% - 5%之間，經(jīng)充分溶解混合即為水相。
[0015] 本發(fā)明還提供了一種抗體，抗上述的一種分離的H9N2禽流感病毒。
[0016] 本發(fā)明還提供了一種診斷試劑，含有上述的一種抗體。
[0017] 本發(fā)明還提供了一種試劑盒，含有上述的一種抗體。
[0018] 本發(fā)明對(duì)分離的抗原群D群H9N2禽流感病毒進(jìn)行了保藏。上述的分離的H9N2禽 流感病毒的分類命名為甲型流感病毒H9N2亞型，該病毒保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理 委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)中，中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的地 址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)（中國(guó)科學(xué)院微生物研究所），保藏日期為2015年 9月8號(hào)，保藏號(hào)為CGMCC NO: 10925。
[0019] 接種本發(fā)明的疫苗，可以預(yù)防本發(fā)明的抗原群D群的H9N2禽流感病毒的感染。使 用本發(fā)明的抗體，可以治療本發(fā)明的抗原群D群的H9N2禽流感病毒的感染。并且本發(fā)明還 可以為禽流感病毒監(jiān)測(cè)系統(tǒng)提供生物信息。
【附圖說明】
[0020] 圖 1 是通過 PRIMER，version 7. 0 (PRIMER-E，Plymouth，United Kingdom)軟件分 析HI滴度，得到抗原性聚類圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 實(shí)施例1病毒的獲得
[0022] 于2013年從上海地區(qū)的活禽批發(fā)市場(chǎng)雞群獲得，采集活禽樣品包括氣管或泄殖 腔拭子，將采集樣品放在含有抗菌素的pH值7. 0-7. 4的等滲磷酸鹽緩沖液（PBS)內(nèi)。將 鑒定為陽(yáng)性樣品的棉拭子充分捻動(dòng)、抒干后棄去拭子，樣品液經(jīng)l〇〇〇r/min離心10min， 取上清液作為接種材料。取處理好的樣品以〇.2mL/胚的量經(jīng)尿囊腔途徑接種9日齡-11 日齡SPF雞胚，每個(gè)樣品接種5個(gè)胚，于35°C -37°C孵化箱內(nèi)孵育，18h后每8h觀察雞胚 死亡情況。無(wú)菌收取18h以后的死胚及96h仍存活雞胚的雞胚尿囊液，測(cè)血凝活性，通 過下面的實(shí)施例對(duì)從雞胚尿囊液中的病毒進(jìn)行基因測(cè)序和鑒定，是一種新抗原群的甲型 流感病毒H9N2禽流感病毒，對(duì)此進(jìn)行了保藏，保藏號(hào)為：CGMCC N0:10925 (A/chicken/ Shanghai/1107/2013) 〇
[0023] 實(shí)施例2 H9N2禽流感病毒的全基因測(cè)序
[0024] 2. 1于2013年從上海地區(qū)的活禽批發(fā)市場(chǎng)雞群中獲得，共分離、鑒定了一株H9N2 禽流感病毒：A/chicken/Shanghai/1107/2013(保藏號(hào)為：CGMCC NO :10925)。首先對(duì)雞氣 管和泄殖腔樣品用H9熒光RT-PCR試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，將H9陽(yáng)性樣品處理后接種雞胚尿囊 腔，將分離毒尿囊液應(yīng)用β -微量法進(jìn)行HA試驗(yàn)，以檢測(cè)其血凝性及HA效價(jià)。根據(jù)HA試 驗(yàn)中所測(cè)得的HA效價(jià)，將分離毒尿囊液配制成4單位的溶液，分別用新城疫陽(yáng)性血清，禽流 感Η5和Η9陽(yáng)性血清進(jìn)行HI試驗(yàn)，以檢測(cè)該分離物的血凝性是否能被禽流感Η9陽(yáng)性血清 所抑制，詳細(xì)步驟按照GB/U 18936-2003高致病性禽流感診斷技術(shù)。這1株病毒感染的雞 胚尿囊液血凝性能夠被Η9型陽(yáng)性血清所抑制，而不能被Η5型陽(yáng)性血清所抑制，表明這1株 病毒為Η9亞型。NA基因通過測(cè)序?yàn)棣?亞型。
[0025] 2. 2將陽(yáng)性樣本接種SPF雞胚，取感染雞胚尿囊液用TRIzoI抽提試劑進(jìn)行RNA的 抽提。2. 3 8個(gè)基因片段RT-PCR擴(kuò)增如下：采用20 μ L的cDNA合成體系置于0. 2mL反應(yīng) 管中，取溶于DEPC處理水中的AIV RNA樣品9 μ L，分別加入上游引物3 μ L，5倍RT-PCR緩 沖液 4 μ L，dNTPs (lOmmol/L) 2. 5 μ L，RNA 酶抑制劑 0· 5 μ L，AMV 反轉(zhuǎn)錄酶 2 μ L，用無(wú) RNase 的超純水加至總體積為20 μ L，置于PCR儀中進(jìn)行cDNA合成，以30°C 10min，42°C 60min，進(jìn) 入PCR擴(kuò)增。
[0026] PCR反應(yīng)體系IOOyL:在PCR反應(yīng)管中分別加入cDNAlO μ L，上、下游引物各 3yL(20pmol/yL)，10XLA PCR BufferlOyL，dNTPs(2.5mmol/L)10yL，MgCl2(25mmol/ L) 8 μ L，LA Taq DNA聚合酶0. 5 μ L (5U/