鴨腸炎病毒gE、gI雙基因缺失病毒株的構(gòu)建及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種鴨腸炎病毒gE、gl雙基因缺失病毒株的構(gòu)建及其應(yīng)用，屬于生物 技術(shù)和獸用生物制品領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 鴨腸炎病毒（Duck enteritis virus, DEV)，又名鴨痕病毒，可感染鴨、鸛及其它雁 形目禽類，引起血管損傷、組織出血、消化道粘膜損傷、淋巴器官受損和實質(zhì)性器官退行性 病變的一種急性、接觸性、敗血性傳染病--鴨病毒性腸炎（Duck viral enteritis, DVE)， 或稱鴨痕（Duck plague，DP)(Sandhu and Metwally，2008)。自 1923 年被首次發(fā)現(xiàn)以來 (Baudet，1923)，本病相繼發(fā)生于法國、印度、比利時、英國、泰國和加拿大等國家（殷震和 劉景華，1997)，流行范圍、感染禽類的種類有逐步擴(kuò)大的趨勢，至少48種雁形目中的禽類 對DEV易感（Kaleta etal.，2007)。鴨瘟是一種廣泛嗜全身性感染的傳染病，發(fā)病率和死亡 率都很高，給水禽養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失。免疫接種是預(yù)防和控制該病暴發(fā)的重要措施，目前 我國用于鴨瘟預(yù)防的疫苗主要是上世紀(jì)60年代研究成功的雞胚弱化活疫苗。DEV具有良好 的免疫原性，免疫力產(chǎn)生快速，免疫后3天便可抵抗鴨瘟強(qiáng)毒攻擊；免疫期長，可達(dá)一年。
[0003] DEV屬于皰疼病毒科、甲型皰疼病毒亞科、馬立克病毒屬、鴨皰疼病毒1型 (http://www. ictvonline. org)。李玉峰應(yīng)用Shot-gun方法首次完成了 DEV--我國鴨 瘟商品化疫苗（DEV VAC)的全基因組測序。DEV VAC基因組全長為158, 089bp，G+C含量 為44. 91%，由長獨特區(qū)（Unique Long, UL)和短獨特區(qū)（Unique Short, US)組成，US區(qū)兩 端為一對反向重復(fù)序列，分別稱為內(nèi)部重復(fù)序列（Internal R印eat, IR)和末端重復(fù)序列 (Terminal R印eat, TR)。基因組結(jié)構(gòu)為UL-IR-US-TR，呈典型的D型皰疹病毒基因組結(jié)構(gòu) (Li et al.，2009)。我們完成了我國鴨腸炎病毒強(qiáng)毒參考株全基因組序列測定，該毒株基 因組全長為162, 131bp，共78個0RF，編碼76個蛋白（Yang et al.，2014)。
[0004] 隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，重組病毒活載體疫苗成為當(dāng)前新型疫苗研究的熱點。 DEV作為活疫苗載體具有以下優(yōu)點：（1)基因組容量大，可插入和表達(dá)多種外源基因；(2)產(chǎn) 生免疫力，免疫后3天即可產(chǎn)生一定的保護(hù)；(3)免疫期長，可達(dá)1年；(5)宿主范圍廣，至少 可感染48種雁形目中的禽類（Kaleta et al·，2007)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于構(gòu)建一株gE、gl雙基因缺失的鴨腸炎病毒作為活病毒載體，同 時將其作為生產(chǎn)種毒用于生產(chǎn)鴨瘟活疫苗，即本發(fā)明以中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心 (CVCC)保存的鴨瘟病毒強(qiáng)毒株（目錄編碼為CVCC AV1221，中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理 中心編著.中國獸醫(yī)菌種目錄第二版，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2002, pl38)為親本毒，應(yīng) 用分子生物學(xué)方法，構(gòu)建了缺失gE、gl雙基因、攜帶綠色熒光蛋白（GFP)標(biāo)記的重組DEV， 該重組病毒可作為疫苗候選毒株，也可作為活病毒載體，用于基因工程疫苗的開發(fā)和應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案
[0007] 1. -株鴨腸炎病毒gE、gl雙基因缺失病毒株，其特征在于該株為為鴨腸炎病毒 (Duckenteritis virus, DEV)rDEV AgEgI-GFP 株，該毒株已于 2015 年 11 月 11 日送交北京 市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普 通微生物中心保藏，保藏編號為：CGMCC No. 11499。
[0008] 2. -株鴨腸炎病毒株，其特征在于該株為缺失gl、gE基因帶有綠色熒光蛋白 (GFP)標(biāo)記的重組鴨腸炎病毒，
[0009] 3.權(quán)利要求1所述的一株鴨腸炎病毒株，其特征在于該毒株的構(gòu)建包括下述步 驟：
[0010] (1)親本病毒的培育：將鴨瘟病毒CVCC AV1221強(qiáng)毒株經(jīng)雞胚成纖維細(xì)胞和雞胚 連續(xù)傳代獲得的克隆純化弱毒株作為親本毒株；
[0011] ⑵轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建：以PMD-18T克隆載體為骨架載體，分別PCR擴(kuò)增gl基因的 上游序列、gE基因的下游序列，作為同源重組的左右同源臂，然后在左右同源臂間插入GFP 基因，獲得轉(zhuǎn)移載體pT-gEgl-GFP ;
[0012] (3)綠色熒光蛋白標(biāo)記重組鴨腸炎病毒的構(gòu)建將pT-gEgl-GFP轉(zhuǎn)移載體與重組鴨 腸炎病毒親本株共轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞，通過克隆篩選，獲得含GFP標(biāo)記蛋白的缺失重組病毒鴨腸 炎病毒 rDEV- Δ gEgl-GFP 株。
[0013] 4. -種鴨瘟活疫苗，其特征在于該疫苗主要含有鴨腸炎病毒rDEV Δ gEgl-GFP株， 該疫苗預(yù)防鴨瘟，可通過檢測gE基因抗體，區(qū)分自然感染和免疫鴨。
[0014] 5.如權(quán)利要求3所述的一種鴨瘟活疫苗的制備方法，其特征在于該疫苗是將重組 鴨腸炎病毒（rDEV△ gEgl-GFP)接種長滿單層的無特異性病原雞的雞胚成纖維細(xì)胞，收獲 病毒培養(yǎng)物，加適宜穩(wěn)定劑，經(jīng)冷凍真空干燥制成疫苗。
[0015] 6.權(quán)利要求1所述的一株鴨腸炎病毒株的應(yīng)用，其特征在于該重組病毒鴨腸炎病 毒rDEV △ gEgl-GFP株作為載體還可插入一種動物病原抗原基因，制備基因工程活載體疫 苗。
【具體實施方式】
[0016] 1.毒株的構(gòu)建
[0017] ⑴病毒和載體
[0018] 1)親本毒鴨瘟病毒CVCC AV1221株為親本毒，該毒株來自中國獸醫(yī)微生物菌種 保藏管理中心（北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街8號中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所中國獸醫(yī)微生物菌種 保藏管理中心；參見：中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心編著.中國獸醫(yī)菌種目錄第二版， 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2002, p 138)。
[0019] 2) PMD-18T載體，用于克隆測序及轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建，購自寶生物工程（大連）有限 公司。含有GFP基因的載體pT-GFP-gpt，均由本實驗室保存。
[0020] ⑵引物設(shè)計
[0021] 根據(jù)GenBank上發(fā)表的DEV序列設(shè)計合成以下引物：
[0022] 表1本發(fā)明構(gòu)建所涉及的相關(guān)引物信息
[0023]
[0024] 3. DEV基因組DNA提取
[0025] 取鴨腸炎病毒 CVCC AV1221 病毒液 437.5 4 1^，加入蛋白酶1((2〇11^/1^)12.5 4 1^、 10% SDS50yL ;56°C水浴Ih ;分別用酸、酚/氯仿/異戊醇（25:24:1)、氯仿各抽提1次；取 上清，加入1/10體積3M醋酸鈉和2倍體積的無水乙醇，-20°C放置30min ; 12000 Xg離心 lOmin，沉淀用70%乙醇洗滌1次，沉淀溶于30 μ L去離子水中，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0026] 4.轉(zhuǎn)移載體 pT-gEgl-GFP-gpt 的構(gòu)建
[0027] 以鴨腸炎病毒CVCC AV1221基因組DNA為PCR擴(kuò)增模板，以引物US7F、US7R擴(kuò)增 gl基因的上游1368bp片段。以引物US8F、US8R擴(kuò)增gE基因的右端1323bp片段。擴(kuò)增目 的片段分別連接PMD-18T載體，構(gòu)建相應(yīng)的重組質(zhì)粒pT-gl和pT-gE。用Sail和HindIII 雙酶切上述重組質(zhì)粒，分別回收3900bp和1300bp片段，獲得重組質(zhì)粒pT-gEgl。將重組質(zhì) 粒pT-gEgl用Sail酶切，電泳回收后去磷酸化；pT-GFP-gpt用Sail酶切，電泳回收2. Ikb 片段，將GFP-gpt表達(dá)盒插入到pT-gEgl中，獲得轉(zhuǎn)移載體pT-gEgl-GFP-gpt。
[0028] 5.同源重組
[0029] 按照Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書，將轉(zhuǎn)移載體pT-gEgl-GFP-gpt與 DEV進(jìn)行轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞（CEF)。具體步驟如下：
[0030] 六孔板中的CEF培養(yǎng)至長成70%~90%細(xì)胞單層時，接種適量的DEV，吸附1~ 4小時；將1 μ g轉(zhuǎn)移載體稀釋于不含血清和抗生素的opti-DMEM中，使混合液的終體積 均為50 yL，室溫孵育5min;取2 yL Lipofectamine 2000與48 yL不含血清和抗生素的 opti-DMEM輕輕混勻，室溫孵育5min ;將50 μ L Lipofectamine 2000稀釋液分別滴加到 50yL質(zhì)粒稀釋液中，邊加邊混勻；室溫孵育20min。在此期間，將六孔板中的細(xì)胞用無血 清OPTI-MEM輕輕洗兩遍后，每孔加入0. 5mL無血清0ΡΤΙ-ΜΕΜ，將100 μ L Lipofectamine 2000/DNA復(fù)合物逐滴加入到6孔板中，輕輕搖動使其均勻混合，置37°C培養(yǎng)4h，棄去上清， 加入10%胎牛血清的[99培養(yǎng)基，置37°(：培養(yǎng)2411后，用1%胎牛血清的[99培養(yǎng)基換 液，置37°C培養(yǎng)3~5d，每天觀察，直至出現(xiàn)重組病毒熒光斑。
[0031] 6.重組病毒的蝕斑純化
[0032] 將初步獲得的重組病毒接種已長成良好細(xì)胞單層的6孔板CEF細(xì)胞，吸附1小時 后，棄去吸附液，鋪上1 %的低熔點瓊脂糖，繼續(xù)培養(yǎng)。接種48小時后在熒光顯微鏡下觀 察綠色熒光，挑選單個熒光蝕斑于0. 5ml M199營養(yǎng)液中，凍融1次后接種6孔板CEF細(xì) 胞，如此進(jìn)行蝕斑純化3~4次，將獲得的重組病毒命名為鴨腸炎病毒（Duck enteritis virus，DEV)rDEVAgEgI-GFP株，該株病毒已于2015年11月