一種檸檬酸發(fā)酵工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及檸檬酸發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種高溫烘干玉米檸檬酸發(fā)酵工藝。
【背景技術(shù)】
[0002] 檸檬酸（Citric acid)又名枸櫞酸，學(xué)名為2-羥基丙烷三羧酸、2-羥基丙 燒-1，2, 3_ 三羧酸（2-hydroxypropane-l, 2, 3-tricarboxylic acid)，分子式 C6Hs07。它是 無色透明或半透明晶體，或粒狀、微粒狀粉末，無臭，雖有強(qiáng)烈酸味，但令人愉快，稍有后澀 味，安全無毒，被廣泛用作食品和飲料的酸味劑。生產(chǎn)檸檬酸的主要原料為玉米、瓜干、木 薯，其中以玉米作為原料的居多，而在我國東北地區(qū)的玉米產(chǎn)量占全國的30%左右，東北地 區(qū)的玉米由于其自然氣候特點(diǎn)，玉米收獲時(shí)的含水量較高（25% -30% )，目前收購企業(yè)主 要采用熱風(fēng)干燥方式方式（干燥溫度在55-65Γ )將玉米含水率降至14%，以達(dá)到安全儲 存的要求，但在高溫烘干過程中玉米的蛋白質(zhì)、蛋白酶及維生素等微量元素都受到一定程 度的破壞，從而對檸檬酸種子培養(yǎng)及發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)生一定的影響，導(dǎo)致種子質(zhì)量下降、種齡延 長、發(fā)酵速率降低、周期延長?，F(xiàn)有技術(shù)中采用的玉米原料主要是自然晾干玉米。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明針對現(xiàn)有高溫烘干玉米檸檬酸發(fā)酵培養(yǎng)遇到的諸多技術(shù)瓶頸，提供了一種 高溫烘干玉米檸檬酸發(fā)酵培養(yǎng)工藝，其特點(diǎn)是在檸檬酸種子罐及發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中，通過 添加混合氮源及微量元素來彌補(bǔ)高溫烘干玉米營養(yǎng)成分的損失以達(dá)到理想的培養(yǎng)效果；本 發(fā)明根據(jù)菌種生長及產(chǎn)酸階段的不同特性，通過調(diào)控氮源的種類及配比、添加微量元素，以 達(dá)到最優(yōu)的培養(yǎng)效果。采用本發(fā)明的工藝后，不僅能提高高溫烘干玉米檸檬酸發(fā)酵種子培 養(yǎng)效果，縮短種齡，提高發(fā)酵穩(wěn)定性，而且能加快發(fā)酵生產(chǎn)強(qiáng)度、提高發(fā)酵糖酸轉(zhuǎn)化率和設(shè) 備利用率，進(jìn)而提高了企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，提升了企業(yè)的競爭力。
[0004] 本發(fā)明所采用的具體技術(shù)方案如下：其具體步驟為：
[0005] (1)將高溫烘干玉米粉碎，調(diào)漿，加入耐高溫α -淀粉酶，經(jīng)二次高壓蒸汽噴射液 化后得玉米液化液；
[0006] (2)將玉米液化液I和硫酸銨加入種子罐中，加水定容，制備成檸檬酸種子罐培養(yǎng) 基，蒸汽消毒后保壓降溫待用；
[0007] (3)配制種子罐微量元素溶液，滅菌待用；
[0008] (4)將黑曲霉孢子加入無菌水中制成孢子懸浮液并將其接入檸檬酸種子罐培養(yǎng)基 進(jìn)行培養(yǎng)，得種子液；培養(yǎng)過程中通過連續(xù)流加方式加入種子罐微量元素溶液；
[0009] (5)將玉米液化液II用壓濾機(jī)壓濾得到液化清液，將液化清液、玉米液化液III、 尿素和玉米漿加入發(fā)酵罐中，加水定容制備成發(fā)酵罐培養(yǎng)基，蒸汽消毒，保壓降溫后待用；
[0010] (6)配制發(fā)酵罐微量元素溶液，滅菌后待用；
[0011] (7)將培養(yǎng)好的種子液轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵過程中通過連續(xù)流加的 方式加入發(fā)酵罐微量元素溶液。
[0012] 步驟（1)中采用55-60°C的水進(jìn)行調(diào)漿，溫水有利于面粉溶解，調(diào)漿均勻，如果 溫度超過60°C玉米就會糊化，漿液粘稠不利于輸送。水與玉米的質(zhì)量比為2. 5-3. 0:1主 要考慮液化完之后玉米液化液的總糖濃度為：20-22g/100mL，最終配置的發(fā)酵液糖度在 17. 5-18. 5g/100mL，發(fā)酵液糖度多過高影響菌種的耐受性，糖度低則浪費(fèi)水、設(shè)備利用率 低。
[0013] 液化完成后取一部分玉米液化液I加入種子罐中進(jìn)行培養(yǎng)。步驟（2)中玉米液 化液I與硫酸銨的含氮比為2. 5-2. 6:1，種子罐培養(yǎng)基中總糖濃度為：9. 5-10. 5g/100mL， 總氮濃度為：〇. 22-0. 24g/100mL。本發(fā)明根據(jù)總氮濃度（0. 22-0. 24g/100mL)以及總糖濃 度（9. 5-10. 5g/100mL)加入硫酸銨及玉米液化液I，總氮過低菌體生長受影響，從而影響到 產(chǎn)酸，總氮過高菌體瘋長，耗糖，不利于產(chǎn)酸；總糖多過高影響菌種的耐受性，糖度低則浪費(fèi) 水、設(shè)備利用率低。制備成的檸檬酸種子罐培養(yǎng)基在121°C滅菌30min，保壓降溫后待用；
[0014] 步驟（3)中種子罐微量元素溶液的具體配置過程為：取CuSO4 · 7H20 40-50mg， ZnSO4 · 7H20 35-40mg，MnSO4 · H2O 30-35mg，Na2MoO4 · 2H20 60-70mg，溶于去離子水中，定容 至500mL，滅菌待用。溶液中的Cu'Zn'Mn2+和Mo 6+對黑曲霉菌絲體的生長明顯的促進(jìn)作 用。
[0015] 將麩曲房培養(yǎng)好的黑曲霉孢子加入冷卻后的無菌水，制成孢子懸浮液。將孢子菌 液通過平板稀釋分離法制成單菌落平板，培養(yǎng)成單菌落，通過菌落計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，按照每毫升 種子液中接入70-80萬個(gè)黑曲霉孢子的比例，通過火焰圈接種法將孢子懸浮液接入滅菌降 溫后的種子罐培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)溫度、風(fēng)量、罐壓及攪拌轉(zhuǎn)速進(jìn)行培養(yǎng)；一般2-3個(gè)黑曲霉孢子 結(jié)合成一個(gè)黑曲霉菌球，而發(fā)酵液中菌球數(shù)在3-4萬/ml時(shí)形成的菌球直徑適中，表面積大 原料利用率高，產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，所以要求種子液接入70-80萬個(gè)黑曲霉孢子。
[0016] 種子液的具體培養(yǎng)過程為：培養(yǎng)0_6h階段，控制培養(yǎng)溫度：35. 0°C -36. 0°C;罐壓： 0· 08MPa-0. 085MPa ;通風(fēng)比：0· IOVAV .min)-0· 12VAV .min);攪拌速率：IOOrpm-IIOrpm ;
[0017] 培養(yǎng)6-25h階段，控制培養(yǎng)溫度：36. 5°C -37. (TC;罐壓：0. 09Mp-0.1 OMPa ;通風(fēng)比： 0· 15V/(V · min)-〇. 16V/(V · min)，攪拌速率：200rpm-220rpm ;通過連續(xù)流加方式進(jìn)行流加 微量元素，流量為每m3發(fā)酵液每h加 I. 20ml-l. 25ml種子罐微量元素，通過單因素實(shí)驗(yàn)發(fā) 現(xiàn)流量過高或過低都不利于菌絲體的生長。
[0018] 0_6h階段為種子的萌發(fā)階段，控制較低的溫度、風(fēng)量、罐壓機(jī)攪拌轉(zhuǎn)速有利于種子 的萌發(fā)；
[0019] 6_25h階段為黑曲霉生長旺盛期，需氧量加大，因此將溫度、風(fēng)量、罐壓及攪拌轉(zhuǎn)速 相應(yīng)調(diào)高，同時(shí)添加微量元素，以滿足菌體生長的需求。
[0020] 將另一部分玉米液化液II用廂式板框壓濾機(jī)壓濾得到液化清液，根據(jù)總氮、總 糖加液化清液、玉米液化液III、尿素和玉米漿于發(fā)酵罐中，加水定容，制備成發(fā)酵罐培養(yǎng) 基，蒸汽消毒，保壓降溫后待用。該步驟中總糖濃度為：17. 5-18. 5g/100mL，總氮濃度為： 0. 10g/100mL ;總培養(yǎng)時(shí)間為：56-60h，菌球濃度為3-4萬個(gè)/mL。
[0021] 發(fā)酵罐微量元素溶液配制：CuSO4. 7H20 0· 15g-0. 20g，ZnSO4. 7H20 2. 0-2. 2g， MnCl2. 4H20 0· 5-0. 6g，F(xiàn)eSO4. 4H20 0· 3-0. 4g，CoCl. 4H20 0· 15-0. 20g，Na2MoO4. 2 菌待用；其 中，Cu' Zn2+、Mn2+和Mo 6+對黑曲霉菌絲體的生長明顯的促進(jìn)作用，Mn 2+和EDTA對產(chǎn)檸檬酸 關(guān)鍵酶-磷酸果糖激酶有明顯的激活作用，而Fe2+能抑制檸檬酸分解酶-α -酮戊二酸脫氫 酶的活性，從而阻遏了檸檬酸的降解，使檸檬酸得到積累。按每m3發(fā)酵液25ml上述濃度的 微量元素溶液配制，通過單因素及正交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在上述濃度范圍微量元素對菌體生長及酶 的激活作用最強(qiáng)，濃度降低作用降低，濃度繼續(xù)提高，激活作用沒有明顯的提高，因此選用 上述濃度。H 2O 0. 12-0. 15g，和EDTA2. 0-2. 5g，溶于適量去離子水中，定容至500mL，滅
[0022] 種子培養(yǎng)好后，用無菌轉(zhuǎn)運(yùn)方法將種子液轉(zhuǎn)入滅菌降溫后的發(fā)酵罐培養(yǎng)基，種子 液與發(fā)酵液的體積比為1:10,調(diào)節(jié)溫度、風(fēng)量、罐壓及攪拌轉(zhuǎn)速開始發(fā)酵；
[0023] 其中O-Sh階段，菌種剛從種子罐轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐，為了保證菌種適應(yīng)的新的環(huán)境，同 時(shí)由于菌體主要還處于生長階段，所以將培養(yǎng)條件控制為培養(yǎng)溫度：36. 5-37. (TC ;罐壓： 0· 09-0.1 OMPa ;通風(fēng)比 VAV · min) :0· 15-0. 17 ;攪拌速率：250-270rpm ;
[0024] 8-48h階段，菌體開始進(jìn)入產(chǎn)酸高峰期，需氧量上升，同時(shí)需要各種微量元素來維 持各種酶的活性，因此將培養(yǎng)條件控制為培養(yǎng)溫度：36. 5-37. (TC ;罐壓：0. 09-0.1 OMPa ;通 風(fēng)比：0. 18-0. 20VAV · min);攪拌速率：350-370rpm ;同時(shí)開始流加發(fā)酵罐微量元素溶液， 流量為每m3發(fā)酵液每h加 I. 20ml-l. 25ml上述濃度的發(fā)酵液微量元素溶液；
[0025] 48-56h階段，菌體產(chǎn)酸速度將低，控制罐壓：0. 09-0.1 OMPa ;通風(fēng)比：0. 15-0. 17V/ (V · min);