一種牦牛奶酪蛋白磷酸肽的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種牦牛奶酪蛋白磷酸肽的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]酪蛋白磷酸肽(CPP)是以乳酪蛋白為原料，通過生物技術(shù)制得，具有促進(jìn)鈣、鐵、鋅等二價(jià)金屬離子吸收和利用的多肽，可用于各種營養(yǎng)、保健食品。酪蛋白磷酸肽是用胰酶或胰蛋白酶水解的酪蛋白，經(jīng)過精制、純化制成，其核心結(jié)構(gòu)為:-Ser (P) -Ser (P) -Ser (P) _Glu-Glu-(Ser:絲氨酸，Glu:谷氨酸，P:磷酸基)。這一結(jié)構(gòu)中的磷酸絲氨酸殘基(_Ser(P)_)成簇存在，在腸道pH弱堿性環(huán)境下帶負(fù)電荷，可阻止消化酶的進(jìn)一步作用，使酪蛋白磷酸肽不會(huì)被進(jìn)一步水解。酪蛋白磷酸肽能在小腸下端pH 7?8環(huán)境下與鈣結(jié)合而抑制磷酸鈣沉淀的形成，使游離鈣保持較高的濃度，促進(jìn)鈣的被動(dòng)吸收。
[0003]盡管早在50年代，國外就開始了對(duì)酪蛋白磷酸肽的研究，但工業(yè)化制備的研究工作直到近年才真正開始，而我國在酪蛋白磷酸肽的研究方面較少。傳統(tǒng)酪蛋白磷酸肽生產(chǎn)工藝，技術(shù)含量低，酪蛋白磷酸肽含量低(最高CPP含量多為20%左右)、產(chǎn)品有苦味、顏偏黃等缺點(diǎn)。如中國專利201310054681.5公開的一種制備酪蛋白磷酸肽的方法，采用在酪蛋白中加入蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng)，利用超濾膜分離出酶解產(chǎn)物酪蛋白磷酸肽，產(chǎn)物酪蛋白磷酸肽經(jīng)納濾膜脫鹽處理后即得。該方法操作簡單，設(shè)備要求低，收率高，產(chǎn)品質(zhì)量好，而且反應(yīng)溫度低，能實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，但其采用單一蛋白酶酶解，酪蛋白磷酸肽得率和含量較低(最高產(chǎn)品含量為16%左右)、產(chǎn)品沒有進(jìn)行脫苦。又如中國專利CN103571905B公開的一種牛乳高純度酪蛋白磷酸肽的制備方法，此方法使用用胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、凝乳蛋白酶和木瓜蛋白酶任意四中組成的復(fù)合蛋白酶和胃蛋白酶對(duì)牛乳酪蛋白進(jìn)行二次酶解，酶解效果比一次酶解法好。但是此方法在后期大量使用色譜法對(duì)酶解之后的酪蛋白磷酸肽進(jìn)行純化，使生產(chǎn)成本大大提升，生產(chǎn)周期變長，產(chǎn)量下降，并不適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種純度高、無苦味、水溶性好、流動(dòng)性好、顏色為純白色的、工藝簡單可應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)、成本較低的牦牛奶酪蛋白磷酸肽的制備方法，以解決上述【背景技術(shù)】中提出的問題。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0006]—種牦牛奶酪蛋白磷酸肽的制備方法，由以下步驟組成:
[0007](1)向牦牛奶酪蛋白中加入牦牛奶酪蛋白6?10倍質(zhì)量的水，在40°C?50°C條件下攪拌溶解；得到牦牛奶酪蛋白溶液；
[0008](2)兩步酶解:
[0009]向上述牦牛奶酪蛋白溶液中，加入相當(dāng)于牦牛奶酪蛋白質(zhì)量0.1-0.2%的蛋白酶進(jìn)行第一步酶解，酶解溫度為30?60°C，酶解反應(yīng)pH值控制在6?8，酶解時(shí)間為3?12小時(shí)；酶解結(jié)束后升溫至80?85°C，恒溫10?20min滅酶，得到一次酶解液；再在一次酶解液中加入相當(dāng)于牦牛奶酪蛋白質(zhì)量0.1-0.2%的酸性蛋白酶進(jìn)行第二步酶解，酶解溫度為40?60°C，酶解反應(yīng)pH值控制在3?6，酶解3?12小時(shí)；酶解結(jié)束后升溫至80?85°C，恒溫10?20min滅酶，得到二次酶解液；
[0010](3)純化濃縮:
[0011]用離心機(jī)除去二次酶解液的固體殘?jiān)?；所得清液用分子量?000Da?lOOOODa的超濾膜去除大分子雜質(zhì)，再用分子量為lOOODa的納濾膜去除無機(jī)鹽和小分子雜質(zhì)并濃縮，得到牦牛奶酪蛋白磷酸肽溶液；
[0012](4)快速干燥:
[0013]噴霧干燥牦牛奶酪蛋白磷酸肽溶液，得到牦牛奶酪蛋白磷酸肽。
[0014]作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:所述步驟(2)中第一步酶解所用蛋白酶為胰蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶的一種或任意兩種組合。
[0015]作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:所述步驟(2)中調(diào)節(jié)pH所用堿為碳酸氫鈉或氫氧化鈉，所用酸為鹽酸。
[0016]作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:所述步驟(3)中離心機(jī)為10000?15000rpm的離心機(jī)。
[0017]作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:所述步驟(3)中所使用的超濾膜，膜壓力為0.5?IMPa，工作溫度為25?40°C ;所使用的納濾膜，膜壓力為1?2MPa，工作溫度為25?40°C。
[0018]作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:所述步驟(3)中使用納濾膜后，濃縮二次酶解液至原體積的5%?20%。
[0019]作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:所述步驟(4)中噴霧干燥的出風(fēng)溫度為70?90°C，進(jìn)風(fēng)溫度為140?180 °C。
[0020]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0021]本發(fā)明在傳統(tǒng)酪蛋白磷酸肽生產(chǎn)技術(shù)的基礎(chǔ)上，以牛乳中酪蛋白為原料，經(jīng)過酶解、膜純化、干燥等工藝生產(chǎn)牦牛奶酪蛋白磷酸肽，除雜和濃縮效果好，適合規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)；制備的牦牛奶酪蛋白磷酸肽為白色或淡黃色粉末，純度多90%，得率多17%，分子量處于1000?5000Da，無苦味。本發(fā)明采用離心協(xié)同多級(jí)膜分離系統(tǒng)純化牦牛奶酪蛋白磷酸肽，不僅僅保證了牦牛奶酪蛋白磷酸肽產(chǎn)品的質(zhì)量，還降低了生產(chǎn)成本，提高了產(chǎn)品的生產(chǎn)效率。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0023]實(shí)施例1
[0024]本發(fā)明實(shí)施例中，一種牦牛奶酪蛋白磷酸肽的制備方法，包括以下步驟:
[0025]向反應(yīng)釜中加純水120L，開攪拌200rpm，加熱至50°C，向反應(yīng)釜中緩慢投入牦牛奶酪蛋白20kg，將pH調(diào)至7.8。向上述牦牛奶酪蛋白溶液中，加入0.05kg的胰蛋白酶進(jìn)行第一步酶解，酶解溫度為40°C，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 7.0,酶解6小時(shí)，酶解結(jié)束后升溫至80°C，恒溫20min滅酶，得到一次酶解液；再在一次酶解液中加入0.05kg的酸性蛋白酶進(jìn)行第二步酶解，酶解溫度為50°C，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH 3.5，酶解6小時(shí)；酶解結(jié)束后升溫至80°C，恒溫20min滅酶，得到二次酶解液。純化濃縮:用lOOOOrpm的離心機(jī)除去二次酶解液的固體殘?jiān)?。所得清液用分子量?000Da的超濾膜去除少量大分子雜質(zhì)，膜壓力為0.7MPa，工作溫度為35°C ;再用分子量為lOOODa的納濾膜去除無機(jī)鹽和小分子雜質(zhì)，膜壓力為1.5MPa，工作溫度為35°C，濃縮二次酶解液至15L，得到純度為92%，分子量處于1000?5000Da，平均分子量為3500Da的牦牛奶酪蛋白磷酸肽溶液；對(duì)濾液進(jìn)行噴霧干燥，得到酪蛋白磷酸肽成品3.72kg，CPP含量多90%，無苦味，水溶性好、20% CPP的水溶液澄清透明。
[0026]實(shí)施例2
[0027]本發(fā)明實(shí)施例中，一種牦牛奶酪蛋白磷酸肽的制備方法，包括以下步驟:
[0028]向反應(yīng)釜中加純水120L，開攪拌200rpm，加熱至50°C，向反應(yīng)釜中緩慢投入牦牛奶酪蛋白20kg，將pH調(diào)至7.8 ;向上述牦牛奶酪蛋白溶液中，加入0.05kg的堿性蛋白酶進(jìn)行第一步酶解，酶解溫度為40°C，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 7.6,酶解6小時(shí)，酶解結(jié)束后升溫至80°C，恒溫20min滅酶，得到一次