與直腸腺癌相關(guān)的基因標(biāo)記物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及MNBA基因在直腸腺癌診斷、治療中的用 途。
【背景技術(shù)】
[0002] 直腸腺癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，在我國，直腸腺癌死亡率居惡性腫瘤第 五位，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，嚴(yán)重危害人類健康。盡管診療技術(shù)不斷發(fā)展，患 者術(shù)后5年生存率并無明顯改善，缺乏有效的診斷方法實現(xiàn)對直腸腺癌及癌前病變的早期 診治是主要的原因之一。直腸腺癌是一種典型的上皮性惡性腫瘤，腺癌是直腸腺癌最主要 的組織學(xué)類型。直腸腺瘤也成為上皮內(nèi)瘤變，根據(jù)組織結(jié)構(gòu)和細胞學(xué)上的異型性可分為低 級別上皮內(nèi)瘤變（I級腺瘤和II級腺瘤）和高級別上皮內(nèi)瘤變（III級腺瘤和原位癌）。直 腸腺瘤發(fā)病率與年齡相關(guān)，40歲以下人群發(fā)病率約20 %~30 %，而40歲以上人群發(fā)病率上 升至40%~50%。目前，腺瘤被公認(rèn)為直腸腺癌最重要的癌前病變，早期發(fā)現(xiàn)并切除腺瘤 病變是降低直腸腺癌發(fā)病率及死亡率的有效手段。
[0003] 直腸腺癌早期臨床癥狀隱匿，不易發(fā)現(xiàn)，大多患者就診時已到中晚期，失去了最 佳手術(shù)時機。有報道表明，早期直腸腺癌患者術(shù)后5年生存率約為90%，而晚期患者僅為 15%。因此，早發(fā)現(xiàn)、早治療是降低直腸腺癌患者高死亡率、改善預(yù)后的關(guān)鍵。目前臨床上 直腸腺癌早期診斷主要依賴于腸鏡、影像學(xué)檢查和血清學(xué)標(biāo)志物癌胚抗原（CEA)等，腸鏡 是直腸腺癌診斷最可靠的方法，但具有侵入性、費用昂貴，患者依從性差；CT和超聲檢查不 易發(fā)現(xiàn)較小病變，對直腸腺癌的早期診斷受到一定限制；CEA是臨床廣泛應(yīng)用的血清標(biāo)志 物，其敏感性和特異性較低，主要用于直腸腺癌患者的治療監(jiān)測。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā) 展，國內(nèi)外研究者不斷探索直腸腺癌新的生物標(biāo)志物，以對傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物進行有效補充， 從而對直腸癌早期診斷、早期治療和預(yù)后提供可能的分子生物學(xué)理論指導(dǎo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種與直腸腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的分 子標(biāo)志物。該基因標(biāo)志物能及時、特異、靈敏的預(yù)判直腸腺癌轉(zhuǎn)移的風(fēng)險、診斷直腸腺癌是 否發(fā)生轉(zhuǎn)移，改善直腸腺癌患者的預(yù)后。
[0005] 本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0006] 本發(fā)明提供了 MNBA基因及其表達產(chǎn)物在制備預(yù)判直腸腺癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險、診斷直腸 腺癌是否發(fā)生轉(zhuǎn)移、判斷直腸腺癌轉(zhuǎn)移是否復(fù)發(fā)的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0007] 進一步，上面所提到的產(chǎn)品能夠通過檢測直腸腺癌組織中MANBA基因的表達水平 來預(yù)判直腸腺癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險、診斷直腸腺癌是否發(fā)生轉(zhuǎn)移、判斷直腸腺癌轉(zhuǎn)移是否復(fù)發(fā)。
[0008] 進一步，所述通過檢測直腸腺癌組織中MANBA基因的表達水平：通過RT-PCR、實時 定量PCR、免疫檢測、原位雜交或芯片檢測MNBA基因及其表達產(chǎn)物的表達水平進行檢測。
[0009] 其中，所述用RT-PCR來預(yù)判直腸腺癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險、診斷直腸腺癌是否發(fā)生轉(zhuǎn)移、判 斷直腸腺癌轉(zhuǎn)移是否復(fù)發(fā)的產(chǎn)品至少包括一對特異擴增MNBA基因的引物；所述用實時定 量PCR預(yù)判直腸腺癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險、診斷直腸腺癌是否發(fā)生轉(zhuǎn)移、判斷直腸腺癌轉(zhuǎn)移是否復(fù)發(fā) 的產(chǎn)品至少包括一對特異擴增MNBA基因的引物；所述用免疫檢測預(yù)判直腸腺癌轉(zhuǎn)移風(fēng) 險、診斷直腸腺癌是否發(fā)生轉(zhuǎn)移、判斷直腸腺癌轉(zhuǎn)移是否復(fù)發(fā)的產(chǎn)品包括：與MNBA蛋白特 異性結(jié)合的抗體；所述用原位雜交預(yù)判直腸腺癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險、診斷直腸腺癌是否發(fā)生轉(zhuǎn)移、判 斷直腸腺癌轉(zhuǎn)移是否復(fù)發(fā)的產(chǎn)品包括：與MNBA基因的核酸序列雜交的探針；所述用芯片 預(yù)判直腸腺癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險、診斷直腸腺癌是否發(fā)生轉(zhuǎn)移、判斷直腸腺癌轉(zhuǎn)移是否復(fù)發(fā)的產(chǎn)品 包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括與MANBA蛋白特異性結(jié)合的抗體，基因芯 片包括與MNBA基因的核酸序列雜交的探針。
[0010] 優(yōu)選地，所述產(chǎn)品包括芯片、試劑盒。
[0011] 本發(fā)明提供了一種預(yù)判直腸腺癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險、診斷直腸腺癌是否發(fā)生轉(zhuǎn)移、判斷直 腸腺癌轉(zhuǎn)移是否復(fù)發(fā)的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品能夠通過檢測直腸腺癌組織中MNBA基因的表達水 平來預(yù)判直腸腺癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險、診斷直腸腺癌是否發(fā)生轉(zhuǎn)移。
[0012] 進一步，所述產(chǎn)品包括芯片、試劑盒。其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片； 所述基因芯片包括固相載體以及固定在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括 用于檢測MNBA基因轉(zhuǎn)錄水平的針對MNBA基因的寡核苷酸探針；所述蛋白質(zhì)芯片包括固 相載體以及固定在固相載體的MNBA蛋白的特異性抗體；所述試劑盒包括基因檢測試劑盒 和蛋白免疫檢測試劑盒；所述基因檢測試劑盒包括用于檢測MNBA基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑； 所述蛋白免疫檢測試劑盒包括MNBA蛋白的特異性抗體。
[0013] 進一步，所述試劑包括使用RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢測、原位雜交或芯片方 法檢測MNBA基因表達水平過程中所需的試劑。優(yōu)選地，所述試劑包括針對MNBA基因的 引物和/或探針。根據(jù)SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列信息設(shè)計出可以用于檢測MNBA基 因表達水平的引物和探針。
[0014] 與MANBA基因的核酸序列雜交的探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其 它衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié) 合，任何長度都可以。所述探針的長度可短至25、20、15、13或10個堿基長度。同樣，所述 探針的長度可長至60、80、100、150、300個堿基對或更長，甚至整個基因。由于不同的探針 長度對雜交效率、信號特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個堿基對，最 長一般不超過30個堿基對，與目的核苷酸序列互補的長度以15-25個堿基對最佳。所述探 針自身互補序列最好少于4個堿基對，以免影響雜交效率。
[0015] 進一步，所述固相載體包括無機載體和有機載體，所述無機載體包括但不限于有 硅載體、玻璃載體、陶瓷載體等；所述有機載體包括聚丙烯薄膜、尼龍膜等。
[0016] 進一步，所述MNBA蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述MNBA 蛋白的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾，例如，嵌合抗體、scFv、 Fab、F(ab'）2、Fv等。只要所述片段能夠保留與MNBA蛋白的結(jié)合能力即可。用于蛋白質(zhì) 水平的抗體的制備時本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且本發(fā)明可以使用任何方法來制備所述抗 體。
[0017] 本發(fā)明還提供了 MNBA基因及其表達產(chǎn)物在制備抑制或預(yù)防直腸腺癌轉(zhuǎn)移、侵襲 的藥物中的應(yīng)用。
[0018] -方面，本發(fā)明所述的"抑制或預(yù)防直腸腺癌轉(zhuǎn)移、侵襲的藥物"包含MNBA基因 和/或其表達產(chǎn)物的抑制劑。所述抑制劑包括抑制MANBA基因表達的物質(zhì)、抑制MNBA基 因表達產(chǎn)物穩(wěn)定性的物質(zhì)、和/或抑制MNBA基因表達產(chǎn)物活性的物質(zhì)。
[0019] 另一方面，本發(fā)明所述的"抑制或預(yù)防直腸腺癌轉(zhuǎn)移、侵襲的藥物"包括能夠括抑 制細胞生長、促進細胞凋亡的物質(zhì)。
[0020] 進一步，本發(fā)明所述的治療直腸腺癌的藥物包括：通過干擾RNA抑制MNBA基因表 達的雙鏈核糖核酸，或基于MNBA抗原蛋白的腫瘤疫苗，或用于抑制MNBA蛋白活性的蛋白 質(zhì)。
[0021] 優(yōu)選的，所述抑制劑是針對MNBA基因的siRNA
[0022] 本發(fā)明還提供了一種用于治療直腸腺癌轉(zhuǎn)移、侵襲的藥物，所述藥物包含MNBA 基因和/或其表達產(chǎn)物抑制劑。所述抑制劑包括抑制MANBA基因表達的物質(zhì)、抑制MNBA 基因表達產(chǎn)物穩(wěn)定性的物質(zhì)、和/或抑制MNBA基因表達產(chǎn)物活性的物質(zhì)。
[0023] 進一步，本發(fā)明所述抑制劑包括：通過干擾RNA抑制MNBA基因表達的雙鏈核糖核 酸，或基于MANBA抗原蛋白的腫瘤疫苗、或用于抑制MNBA蛋白活性的蛋白質(zhì)。
[0024] 本發(fā)明的藥物還可與其他治療直腸腺癌的藥物聯(lián)用，多種藥物聯(lián)合使用可以大大 提尚治療的成功率。
[0025] 進一步，本發(fā)明的藥物還包括藥學(xué)上可接受的載體，這類載體包括（但并不限 于）：稀釋劑如乳糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、淀粉、水等；粘合劑如淀粉、預(yù)膠化淀粉、糊精、 麥芽糖糊精、蔗糖、阿拉伯膠、明膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素、乙基纖維素、聚乙烯醇、聚 乙二醇、聚乙烯比咯烷酮、海藻酸及海藻酸鹽、黃原膠、羥丙基纖維素和羥丙基甲基纖維素 等；表面活性劑如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸鈉、硬脂酸單甘油酯、十六 燒醇等；致濕劑如甘油、淀粉等；吸附載體如淀粉、乳糖、斑脫土、硅膠、高嶺土和阜粘土等； 潤滑劑如硬脂酸鋅、單硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉、硬脂酸鈣和鎂、聚乙二醇、硼酸粉 末、氫化植物油、硬脂富馬酸鈉、聚氧乙烯單硬脂酸酯、單月桂蔗糖酸酯、月桂醇硫酸鈉、月 桂醇硫酸鎂、十二烷基硫酸鎂等；填充劑如甘露醇（粒狀或粉狀）、木糖醇、山梨醇、麥芽糖、 赤蘚糖、微晶纖維素、聚合糖、偶合糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、糊精、淀粉、海藻酸鈉、海帶多糖 粉末、瓊脂粉末、碳酸鈣和碳酸氫鈉等；崩解劑如交聯(lián)乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉鈉、低取代 羥丙基甲基、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、大豆多糖等。
[0026] 本發(fā)明的藥物可以使用不同的添加劑進行制備，例如殺菌劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、等