°C預變性3min后，94°C變性30s，55. 5 °C退火50s， 72°C延伸I. 5min，30個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin);
[0040] S104 :配置 PCR 反應體系：總體積 20 μ 1，包括 10XPCR buffer 2. 5 μ 1， MgC12(25mM)I. 4 μ I，dNTP mix(IOmM each)0· 4 μ I，Pv-F(5 μ Μ)1 μ I，Pv-R(5 μ Μ)1 μ I，DNA template(40ng/mL)2yL，Taq DNA Polymerase(5U/yl)0.2yl，ddH20 11·5μ1。將上述溶 液加在0. 2mL離心管內，混勻后放入PCR儀上，運行PCR程序；
[0041] S105 :PCR 擴增產物電泳：1)配置 I X TBE 緩沖液：54gTris，27. 5g 硼酸，4. 6g EDTANa2溶于去離子水中，定容至5L;2)制備瓊脂糖凝膠：用lXTBE緩沖液配0.8%瓊脂糖 凝膠，將熔化瓊脂糖凝膠溶液倒入電泳支架上，放上梳子，梳子須離開電泳支架底部Imm左 右；待凝膠凝聚后，小心拔去梳子，將支架放入裝有IXTBE緩沖液的電泳槽中，緩沖液應淹 沒過膠；3)加樣：取PCR擴增產物樣品5 μ L，滴加1 μ L上樣緩沖液（含IOmM Tris-Cl pH 7.6,0.03%bromophenol blue，0.03%xylene cyanol，60%glycerol，60mM EDTA)混勾， 用微量移液器加入樣品槽中，并將3 yL 500bp DNA Ladder(購自天根生化科技有限公司） 加入相鄰的點樣孔；4)電泳：凝膠點樣端朝負極，通電，維持電壓為lOv/cm至溴酚藍移到距 邊Icm處，取出凝膠；
[0042] S106 :普通菜豆種質基因庫類型判斷：將電泳后的凝膠放在凝膠成像儀的紫外燈 下觀察，PCR擴增產物會出現(xiàn)800bp或900bp的條帶，擴增產物為800bp對應的種質屬于安 第斯基因庫，擴增產物為900bp對應的種質屬于中美洲基因庫。
[0043] 在本發(fā)明的實施例中：
[0044] PCR 反應體系：總體積 20 μ 1，包括 10 X PCR buffer 2. 5 μ I，MgCl2 (25mM) 1. 4 μ 1， dNTP mix(10mM each)0.4 μ I, Pv-F(5 μ Μ)1 μ I, Pv-R(5 μ Μ)1 μ I, DNA template(40ng/ mL) 2 μ I，Taq DNA Polymerase(5U/μ I)0· 2 μ I，ddH20 11.5 μ I〇
[0045] PCR反應程序：94°C預變性3min后，94°C變性30s，55. 5°C退火50s，72°C延伸 I. 5min，30個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。
[0046] PCR擴增產物檢測：用0. 8 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，取5 μ I PCR擴增產物，滴 加 I y 1上樣緩沖液，混勻，用微量移液器加入樣品槽中，點樣端朝負極，通電（電壓為IOv/ cm)，待溴酚藍移到距凝膠邊Icm處，取出凝膠，紫外燈下檢測。
[0047] 普通菜豆起源分類：凝膠中PCR擴增產物長度為SOObp左右的材料起源于安第斯 基因庫，凝膠中PCR擴增產物長度為900bp左右的材料起源于中美基因庫。
[0048] 通過實驗發(fā)現(xiàn)，普通菜豆品種G19833和D0R364分別是普通菜豆兩個基因庫，安第 斯基因庫和中美洲基因庫的代表，各自具有相應基因庫的典型特點。一個普通菜豆的P5CS 基因（脯氨酸合成酶基因）DNA序列在G19833中的全長為5765bp，在D0R364中全長為 5815bp，D0R364的P5CS基因在787-882位點之間有1個97bp的插入片段，G19833缺失了 這一段序列。根據(jù)這一插入缺失我們應用primer premer 5軟件設計了一對擴增P5CS基因 組部分片段的引物（本發(fā)明中的SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2)，其擴增結果是：在G19833 中獲得一長約800bp的片段，在D0R364中獲得一長約900bp的片段。
[0049] 分別用本發(fā)明的標記Pv97和30對SSR標記對224份普通菜豆材料進行分類，其 中已知80份屬于安第斯基因庫（下表中A)，143份屬于中美洲基因庫（下表中M))。結果 顯示（如下表所示），用該標記分類，223份材料中有217份材料的分類結果與已知類別相 同，正確率為217/223 = 97. 3%;用30對SSR分類，223份材料中204份材料的分類結果與 已知類別一樣，正確率為204/223 = 91. 5%。這些結果證明，本發(fā)明的分子標記可以很好的 鑒別出普通菜豆的種質起源。
[0050]



[0054] 注：表中所用普通菜豆材料和所用30對SSR引物來自Xiaoyan Zhang，Matthew ff. Blair? Shumin Wang. Genetic diversity of Chinese common bean (Phaseolus vulgaris L.)landraces assessed with simple sequence repeat markers. Theoretical and Applied Genetics，2008,117(4) :629-640
[0055] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種鑒定普通菜豆種質起源的引物，其特征在于，所述鑒定普通菜豆種質起源的引 物命名為Pv97 包括：SEQIDNO:1 和SEQIDNO:2 ; 引物序列SEQIDNO:1:Pv-F:5'AGGTTGGGACTGCTGTGGTTAC3' ； 引物序列SEQIDNO:2Pv-R:5'TTTCACAGTTTCGCTGAGTTGC3'。2. -種鑒定普通菜豆種質起源的方法，其特征在于，所述鑒定普通菜豆種質起源的方 法包括： 模板基因組DNA提取與稀釋； 引物SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的合成與稀釋，純化方式選用PAGE，將引物用無菌 的雙蒸水PH8. 0溶解并稀釋至5μΜ; PCR儀的選擇與擴增； PCR擴增產物電泳； PCR擴增產物檢測，將電泳后的凝膠放在凝膠成像儀的紫外燈下觀察，PCR擴增產物會 出現(xiàn)800bp或900bp的條帶，擴增產物為800bp對應的種質屬于安第斯基因庫，擴增產物為 900bp對應的種質屬于中美洲基因庫。3. 如權利要求2所述的鑒定普通菜豆種質起源的方法，其特征在于，所述模板基因組 DNA提取與稀釋具體包括： 將無病蟲害的欲被檢測普通菜豆種子用無菌水浸沒吸脹12小時； 取吸脹的種子剝去種皮和子葉，取三片小的三出復葉于2mL離心管內，加入50μ1提取 緩沖液研磨至糊狀，緩沖液包含l〇〇mMTris-HclpH= 8. 0,1ΜKC1，10mMEDTA; 95°C_100°C煮沸 10 分鐘； 冰上冷卻2分鐘； 用100μ1去離子水稀釋后lOOOOrpm離心3-5分鐘； 取上清液做模板。4. 如權利要求2所述的鑒定普通菜豆種質起源的方法，其特征在于，所述PCR反應 體系：總體積 20μ1，包括 10XPCRbuffer2. 5μ1，MgCl2(25mM) 1. 4μ1，dNTPmix(10mM each) 0· 4μ1，Pv_F(5μΜ) 1μ1，Pv_R(5μΜ) 1μ1，DNAtemplate(40ng/mL) 2μ1，TaqDNA Polymerase(5U/μ1) 0· 2μ1，ddH20 11· 5μ1 〇5. 如權利要求2所述的鑒定普通菜豆種質起源的方法，其特征在于，所述PCR反應程 序：94°C預變性3min后，94°C變性30s，55. 5°C退火50s，72°C延伸1. 5min，30個循環(huán)，最后 72°C延伸 10min。6. 如權利要求2所述的鑒定普通菜豆種質起源的方法，其特征在于，所述PCR擴增產物 電泳具體方法如下： 配置1 X TBE緩沖液：54gTris，27. 5g硼酸，4. 6g EDTANa2溶于去離子水中，定容至5L; 制備瓊脂糖凝膠：用IXTBE緩沖液配0.8 %瓊脂糖凝膠，將熔化瓊脂糖凝膠溶液倒入 電泳支架上，放上梳子，梳子須離開電泳支架底部1mm，待凝膠凝聚后，拔去梳子，將支架放 入裝有1XTBE緩沖液的電泳槽中，緩沖液應淹沒過膠； 加樣：取PCR擴增產物樣品5μL，滴加1μL上樣緩沖液（混勻，緩沖液含10mMTris-Cl pH7.6,0.03%bromophenolblue，0.03%xylenecyanol，60%glycerol，60mMEDTA;用 微量移液器加入樣品槽中，并將3yL500bpDNALadder加入相鄰的點樣孔； 電泳：凝膠點樣端朝負極，通電，維持電壓為lOv/cm至溴酚藍移到距邊lcm處，取出凝 膠。7.如權利要求2所述的鑒定普通菜豆種質起源的方法，其特征在于，所述PCR擴增產 物檢測：用0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，取5μ1PCR擴增產物，滴加1μ1上樣緩沖液，混 勻，用微量移液器加入樣品槽中，點樣端朝負極，通電，電壓為lOv/cm，待溴酚藍移到距凝膠 邊lcm處，取出凝膠，紫外燈下檢測。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鑒定普通菜豆種質起源的引物及方法，引物包括：SEQ？ID？NO：1和SEQ？ID？NO：2；方法包括模板基因組DNA提取與稀釋；引物SEQ？ID？NO：1和SEQ？ID？NO：2的合成與稀釋；PCR儀的選擇與擴增；PCR擴增產物電泳；PCR擴增產物檢測。本發(fā)明很方便的鑒定出該材料的基因庫類型，分別用本發(fā)明的標記和30對SSR標記對223份普通菜豆材料進行分類；標記的分類結果正確率為97.3，SSR的分類結果的正確率為91.5％。本發(fā)明的引物對組成的分子標記屬于單基因插入缺失標記，具有遺傳穩(wěn)定性強，不易變異的特點，且在使用中容易觀察，不同起源的材料具有明顯的標記類型。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105385783
【申請?zhí)枴緾N201511029142
【發(fā)明人】陳吉寶, 王述民, 武晶, 王蘭芬, 增輝, 王晨, 曹苑南, 段鵬飛
【申請人】南陽師范學院
【公開日】2016年3月9日
【申請日】2015年12月31日