H10n8亞型禽流感病毒三重rt-pcr檢測引物組、試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于禽類病毒檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種H10N8亞型禽流感病毒三重 RT-PCR檢測引物組、試劑盒，以及鑒定HlO亞型禽流感病毒、N8亞型禽流感病毒、通用檢測 所有亞型禽流感病毒的引物對或引物對組及其試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 禽流感病毒（Avian Influenza Virus，AIV)根據(jù)表面糖蛋白（Hemagglutinin，HA) 和神經(jīng)氨酸酶（Neuraminidase，NA)抗原性差異分為不同的亞型，目前已發(fā)現(xiàn)有18種HA亞 型（H1-H18)和11種NA亞型（Nl-Nll)。AIV是一種有包膜、單股負(fù)鏈、分節(jié)段的RNA病毒， 病毒基因組由8個分節(jié)段負(fù)鏈RNA組成。由于禽流感病毒基因組呈節(jié)段復(fù)制，通過依賴RNA 聚合酶完成復(fù)制，而RNA聚合酶缺乏校正功能，所以禽流感病毒發(fā)生基因突變的頻率極高。
[0003] 2013年12月6日，江西省南昌市一名73歲女子罹患H10N8亞型禽流感，因呼吸衰 竭、休克死亡，這是全球首例人類感染H10N8的死亡案例。2014年1月25日，也是在南昌， 又確診一例人感染H10N8亞型禽流感的病例。
[0004] 目前，急需建立一種快速檢測H10N8亞型禽流感病毒的方法及開發(fā)相應(yīng)試劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種H10N8亞型禽流感病毒三重RT-PCR檢測引 物組、試劑盒及其應(yīng)用。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0007] -種H10N8亞型禽流感病毒三重RT-PCR檢測引物組，包括3對特異性引物，分別 是引物對H10-1和H10-2、引物對N8-1和N8-2、引物對M-I和M-2,其分別具有如SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 6所示的序列。
[0008] -種用于鑒定HlO亞型禽流感病毒的引物對，包括特異性引物H10-1和H10-2,它 們分別具有序列表SEQ. ID. No. 1至SEQ. ID. No. 2的堿基序列。
[0009] -種用于鑒定N8亞型禽流感病毒的引物對，包括特異性引物N8-1和N8-2,它們分 別具有序列表SEQ. ID. No. 3至SEQ. ID. No. 4的堿基序列。
[0010] -種通用鑒定所有亞型禽流感病毒的引物對，包括特異性引物M-I和M-2,它們分 別具有序列表SEQ. ID. No. 5至SEQ. ID. No. 6的堿基序列。
[0011] -種H10N8亞型禽流感病毒三重RT-PCR檢測試劑盒，包括反轉(zhuǎn)錄試劑、PCR試劑、 DEPC水和RNase-free水，所述的PCR試劑中含有3對特異性引物，分別是引物對H10-1和 H10-2、引物對N8-1和N8-2、引物對M-I和M-2,其分別具有如SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 6 所示的序列。
[0012] 作為優(yōu)選，所述的3對特異性引物H10-1和H10-2, N8-1和N8-2, M-I和M-2在所 述的PCR試劑中的終濃度為0. 1-0. 8 μ M。
[0013] 作為優(yōu)選，所述的反轉(zhuǎn)錄試劑每管16 μ L，其中5XReverse Transcriptase Buffer 10 μL、50pmol 9mer Random Primer 2 μL、IOmM dNTP Mixture 2 μL、40U Ribonuclease Inhibitor I μ L、5U/μ L AMV Reverse Transcriptase lyL〇
[0014] 作為優(yōu)選，所述的 PCR試劑每管 27 μ L，其中 2 XEasyTaqTM PCR SuperMix 25 μ L、 50 μ M H10-1 和 H10-2 引物各 0· 2 μ L、50 μ M N8-1 和 N8-2 引物各 0· 4 μ L、50 μ M M-I 和 M-2 引物各〇. 4yL。
[0015] 本發(fā)明還提供了所述的H10N8亞型禽流感病毒三重RT-PCR檢測引物組、所述的引 物對或所述的H10N8亞型禽流感病毒三重RT-PCR檢測試劑盒在鑒別H10N8亞型禽流感病 毒、HlO亞型禽流感病毒、N8亞型禽流感病毒及其它亞型禽流感病毒中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明具有如下有益效果：
[0017] 1.發(fā)明人專門針對HlO亞型禽流感病毒HA基因、N8亞型禽流感病毒NA基因和所 有禽流感病毒M基因的保守序列，設(shè)計了三對特異性引物，組合成H10N8亞型禽流感病毒三 重RT-PCR檢測試劑盒，一管檢測即可確定是否為H10N8亞型禽流感病毒感染。利用本發(fā)明 的引物對、引物對組或試劑盒，可以檢測待測樣品中是否含有H10N8亞型禽流感病毒、HlO 亞型禽流感病毒、N8亞型禽流感病毒和其他亞型禽流感病毒感染。本發(fā)明建立了一次PCR 反應(yīng)就能同時檢測和鑒別HlO亞型禽流感病毒、N8亞型禽流感病毒、H10N8亞型禽流感病 毒，并確定是否存在其他亞型禽流感病毒的三重RT-PCR檢測試劑盒。通過擴(kuò)增條件優(yōu)化、 特異性和敏感性試驗，建立了 HlO亞型禽流感病毒、N8亞型禽流感病毒和通用檢測禽流感 病毒的三重RT-PCR試劑盒，該試劑盒具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、低成本、高效率等優(yōu)點，可 用于臨床檢測H10N8亞型禽流感病毒，并能確定是否存在其他亞型禽流感病毒的感染。
[0018] 2.由于本發(fā)明在引物設(shè)計上利用擴(kuò)增片段長度的不同直接判定擴(kuò)增結(jié)果，使得 該法在結(jié)果判定時更簡便、直觀和實用。實驗證明，該法對同一樣品中的HlO亞型禽流 感病毒、N8亞型禽流感病毒和禽流感病毒模板進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果均得到與試驗設(shè)計相符的 267bp (H10亞型禽流感病毒）、464bp (N8亞型禽流感病毒）、693bp (禽流感病毒）的特異性 擴(kuò)增條帶，對其他亞型的禽流感病毒，只出現(xiàn)693bp禽流感通用檢測的條帶，對新城疫、傳 染性支氣管炎和傳染性喉氣管炎常見禽病的檢測全為陰性。敏感性試驗結(jié)果表明，該試劑 盒最低能檢測到IO 3拷貝/ μ L的HlO亞型禽流感病毒、N8亞型禽流感病毒及所有亞型禽流 感病毒。
[0019] 3.本發(fā)明可為HlO亞型、Ν8亞型、Η10Ν8禽流感病毒和禽流感病毒的發(fā)病早期提 供準(zhǔn)確的診斷結(jié)果，對切斷其傳播途徑有重要意義，可及時隔離與處理，對Η10Ν8亞型禽流 感的有效防控具有重要意義，應(yīng)用前景廣闊，對養(yǎng)禽業(yè)可持續(xù)發(fā)展也有重要現(xiàn)實意義。
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發(fā)明所建立Η10Ν8亞型AIV三重RT-PCR檢測試劑盒的特異性試驗結(jié)果 圖；
[0021] 其中：M-DLlOOOMarker ;1-Η10+Ν8 ;2-Η10Ν7 ;3-Η6Ν8 ;4-Η1Ν1 ;5-Η1Ν7 ;6-Η2Ν3 ; 7-Η3Ν2 ;8-Η4Ν6 ;9-Η5Ν1 ;10-Η6Ν1 ;11-Η7Ν2 ;12-Η8Ν4 ;13-Η9Ν2 ;14-Η11 ;15-Η12Ν5 ; 16-Η13Ν6 ;17-Η14Ν5 ;18-Η15Ν9 ;19-Η16Ν3 ;20-NDV ;21-IBV ;22-ILTV ;23-陰性對照； 24-空白對照。
[0022] 圖2為本發(fā)明所建立H10N8亞型AIV三重RT-PCR檢測試劑盒的敏感性試驗結(jié)果 圖；
[0023] 其中：1-108拷貝 /yL;2-107拷貝 /yL;3-106拷貝 /yL;4-105拷貝 /yL;5-104 拷貝/ μ L ;6-103拷貝/ μ L ;7-100拷貝/ μ L ;8-空白對照。
【具體實施方式】
[0024] 下面結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的闡述，但本發(fā)明的實施方式并不 局限于實施例表示的范圍。這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而非用于限制本發(fā)明的范圍。此 外，在閱讀本發(fā)明的內(nèi)容后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種修改，這些等價變化同 樣落于本發(fā)明所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0025] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所 使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0026] AIV 毒株（H3N8、H6N8、H1N1、H3N2、H4、H9N2 和 H11)、NDV、IBV 和 ILTV 由廣西獸 醫(yī)研究所分離鑒定保存；AIV毒株（H2N3、H8N4、H10N3、H12N5)由香港大學(xué)惠贈；AIV毒株 (H10N7、H5N1、H7N2、H13N6、H14N5、H15N9 和 H16N3)的 RNA 由美國康涅狄格州大學(xué)惠贈； Minibest viral RNA/DNA extraction kit ver. 4.0和反轉(zhuǎn)錄試劑購自大連寶生物公司； PCR SuperMix購自北京全氏金生物公司。
[0027] 實施例1:禽流感病毒三重RT-PCR的引物設(shè)計及試劑盒的制備
[0028] (1)引物的設(shè)計
[0029] 根據(jù)GenBank中現(xiàn)有公開的HlO亞型AIV的HA基因、N8亞型AIV的NA基因和所 有亞型AIV的M基因共3個基因的保守序列，通過NCBI Blast驗證，設(shè)計并合成了三對特 異性引物（見表1)，用于HlO亞型AIV、N8亞型AIV和所有亞型AIV的檢測。
[0030] 表1引物信息
[0032] 注：AIV H10-1和H10-2引物對用來檢測是否含有HlO亞型禽流感病毒；AIV N8-1 和N8-2引物對用來檢測是否含有N8亞型禽流感病毒；AIV M-I和M-2引物對通用檢測所 有亞型禽流感病毒。
[0033] (2)樣品的制備
[0034] 根據(jù) Minibest viral RNA/DNA extraction kit ver. 4. 0 提取試劑盒說明書，分 別提取上述禽流感病毒、新城疫病毒和傳染性支氣管炎病毒的RNA，提取傳染性喉氣管炎病 毒的DNA。
[0035] (3) H10N8亞型禽流感病毒三重RT-PCR檢測試劑盒的配制
[0036] 對RT-PCR引物濃度、反應(yīng)溫度、時間及循環(huán)次數(shù)等進(jìn)行優(yōu)化，最后確定RT-PCR中 H10-1和H10-2引物在PCR試劑中的最佳終濃度為0. 2 μΜ ;N8-1、N8-2、M-I和M-2的引物 在PCR試劑中的最佳終濃度為0. 4 μ M ;PCR的最佳反應(yīng)模式是94°C預(yù)變性5min，然后進(jìn)入 94°C變性30s，52°C退火30s