具有硫醇基的d-型或l-型氨基酸衍生物的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明是關(guān)于側(cè)鏈有硫醇基的D-型或L-體氨基酸衍生物的制造方法。此外，本 發(fā)明是關(guān)于在側(cè)鏈有硫醇基的D-型或L-體氨基酸衍生物的制造方法所使用的中間體。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年，生物醫(yī)藥的研究開發(fā)的進展，由合成肽及蛋白質(zhì)進行構(gòu)造及機能的解析之 例，及將肽及蛋白質(zhì)作為醫(yī)藥使用之例正增加。肽及蛋白質(zhì)是由氨基酸構(gòu)成，構(gòu)成蛋白質(zhì)的 氨基酸除了側(cè)鏈取代基是氫原子的情況外，α碳原子是不對稱原子之故，有稱為D-型 及L-體的鏡像異構(gòu)物存在。在生物體內(nèi)存在的肽及蛋白質(zhì)，由L-氨基酸所構(gòu)成，所以要合 成在生物體內(nèi)存在的肽及蛋白質(zhì)，其原料需要是有光學(xué)活性的L-氨基酸。此外，近年來，在 蛋白質(zhì)的構(gòu)造解析上，期待提高蛋白質(zhì)的結(jié)晶化效率，而使用消旋蛋白質(zhì)的X射線結(jié)晶構(gòu) 造解析受到注目。其中，消旋蛋白質(zhì)就是作為僅由D-氨基酸所組成的蛋白質(zhì)與僅由L-氨 基酸所組成的蛋白質(zhì)的等量混合物的蛋白質(zhì)。解析蛋白質(zhì)的構(gòu)造是理解蛋白質(zhì)機能的重要 的知識。為了由這種消旋蛋白質(zhì)的結(jié)晶化而進行構(gòu)造解析起見，合成D-蛋白質(zhì)及L-蛋白 質(zhì)的雙方的需要性提高。要將這種D-蛋白質(zhì)及/或L-蛋白質(zhì)制造并安定的供給，則有必 要將作為原料的光學(xué)活性D-氨基酸、L-氨基酸各分別大量以高效率制造。特別是，D-蛋白 質(zhì)為天然不存在，只有由化學(xué)合成才有合成的可能，成為原料的D-氨基酸的工業(yè)生產(chǎn)是必 要不可欠的。
[0003] 此外，要合成高分子的蛋白質(zhì)時，以固相合成等制造肽的方法，則能制造的肽的 長度有限，所以需要將所制造的肽連結(jié)起來。肽結(jié)合法而言，是采用名為自然化學(xué)接合法 NCL(Native Chemical Ligation)的方法。在NCL中，將N末端具有在側(cè)鏈有硫醇基的氨基 酸的肽，與其他肽的C末端，利用硫醇基的反應(yīng)性而結(jié)合。因而，在NCL中，主要是在側(cè)鏈有 硫醇基的氨基酸的半胱氨酸作為結(jié)合部位而設(shè)計蛋白質(zhì)合成。此外，在使用硫醇基的結(jié)合 反應(yīng)后將構(gòu)造改變?yōu)槠渌陌被?，而想出以丙氨酸等作為結(jié)合部位的方法等。但是，雖然 如此，可能作為結(jié)合部位的氨基酸仍舊是非常有限，這一點成為蛋白質(zhì)合成的限制因素。
[0004] 因而，高分子的D-或L-蛋白質(zhì)的制造上，要制造可作為NCL的結(jié)合部位的氨基酸 的話，需要制造在側(cè)鏈經(jīng)導(dǎo)入硫醇基的光學(xué)活性D-或L-氨基酸。但是，這種氨基酸的制造 方法而言，以D-或L-氨基酸作為原料，有嘗試不要發(fā)生異構(gòu)化而經(jīng)由多數(shù)的復(fù)雜的步驟而 在側(cè)鏈導(dǎo)入硫醇基的方法，但由這種方法要以高收量及高收率制造目的之氨基酸是非常困 難。并且，制造光學(xué)活性氨基酸的方法而言，亦存在有關(guān)使用立體選擇性的酶的方法等的報 告（參照專利文獻1，2)。但是，在這些中，沒有特別述及在側(cè)鏈有硫醇基等的所希望的取 代基的氨基酸的制造等。此外，酶有基質(zhì)特異性，所以對于在β位有例如經(jīng)保護的硫醇基 之容積大的取代基的氨基酸衍生物也不能說酶有效。隨后高分子的D-或L-蛋白質(zhì)的制造 上，可作為NCL的結(jié)合部位使用之光學(xué)活性β -硫代氨基酸衍生物，至今為止，還沒有達到 以可使D-或L-蛋白質(zhì)的工業(yè)生產(chǎn)的實施方案而制造的程度。
[0005] [先前技術(shù)文獻]
[0006] [專利文獻]
[0007] [專利文獻1]日本專利特開平6-125786
[0008] [專利文獻2]日本專利特開平11-69992

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009][發(fā)明要解決的課題]
[0010] 本發(fā)明的課題是提供在側(cè)鏈有硫醇基的光學(xué)活性的D-型及/或L-型氨基酸，能 以簡易的方法，以高收率制造的方法為課題。特別是，本發(fā)明人，為了要增加可作為由NCL 的結(jié)合部位的氨基酸的變化，將側(cè)鏈有硫醇基的天然型或非天然型的各種D-或L-氨基酸， 以高收率制造作為課題。
[0011][解決課題的手段]
[0012] 本發(fā)明人為了要解決前述課題精心進行研究。根據(jù)光學(xué)活性D-或L-氨基酸作為 原料的以往方法，不對稱碳原子的立體異構(gòu)的調(diào)控非常困難。于是，本發(fā)明人刻意將有硫醇 基的氨基酸衍生物作為立體異構(gòu)物混合存在的中間體組合物而制造之后，使用酶將α碳 原子的D-型與L-型分離，驚訝的是發(fā)現(xiàn)以比以往較少的步驟數(shù)的簡易方法，以高收率，而 可制造在側(cè)鏈有硫醇基的光學(xué)活性氨基酸衍生物。即，本發(fā)明人著眼于，在NCL法中，可使 用將用于肽結(jié)合反應(yīng)的硫醇基在結(jié)合反應(yīng)后除去的方法。本發(fā)明人想到，將在β位有硫醇 基的氨基酸衍生物（β-硫代氨基酸衍生物），不實施α及β碳原子的立體異構(gòu)的調(diào)控，在 最后作為α碳原子以光學(xué)活性體精制所得者可用于NCL的結(jié)合部位。即，α及β碳原子 是不對稱原子的β -硫代氨基酸衍生物的D-型或L-型，由在NCL反應(yīng)后除去硫醇基，則可 變成只有α碳原子為不對稱碳原子的α碳原子的光學(xué)活性D-型或L-型，而可合適當作 用于NCL結(jié)合部位的氨基酸而使用。
[0013] 再者，本發(fā)明人，為了要制造對天然型或非天然型的各種的氨基酸經(jīng)導(dǎo)入硫醇基 的光學(xué)活性衍生物，精心檢討作為中間體的立體異構(gòu)物混合存在的氨基酸衍生物組合物的 制造方法。其結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，由使用芳族氨基酸或甘氨酸作為原料，對包括天然型氨 基酸的各種的氨基酸在側(cè)鏈經(jīng)導(dǎo)入硫醇基的非天然型氨基酸，可簡易且以高收率制造成為 D-型或L-型氨基酸。
[0014] 即，本發(fā)明是提供在β位有經(jīng)保護或未經(jīng)保護的硫醇基的D-或L-非天然型氨基 酸衍生物的制造方法。該制造方法的特征在于，制造包括D-型及L-型之在β位有經(jīng)保護 或未經(jīng)保護的硫醇基的氨基酸衍生物，對所得的氨基酸衍生物使D-或L-氨基酸選擇性水 解酶中的任一種酶反應(yīng)，隨后分離經(jīng)水解的D-或L-氨基酸衍生物。
[0015] 此外，本發(fā)明的一實施實施方案中，提供在β位有經(jīng)保護或未經(jīng)保護的硫醇基的 D-或L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法，其特征是含有以下的步驟，
[0016] (I)對氨基酸衍生物，實施以下的反應(yīng)，而制造含有D-型及L-型，在β位有經(jīng)保 護或未經(jīng)保護的硫醇基的氨基酸衍生物的步驟
[0017] (A)在該氨基酸衍生物的β碳原子導(dǎo)入保護或無保護的硫醇基的反應(yīng)，
[0018] 以及，
[0019] (B)將結(jié)合在該氨基酸衍生物的α碳原子的氨基或羧基，轉(zhuǎn)變?yōu)橐蔀镈-或 L-氨基酸選擇性水解酶的基質(zhì)的取代基的反應(yīng)，
[0020] 以及，
[0021] (II)對（I)所得的氨基酸衍生物，使D-或L-氨基酸選擇性水解酶中的任一種酶 反應(yīng)，隨后分離經(jīng)水解的D-或L-氨基酸衍生物的步驟。
[0022] 此外，本發(fā)明的一實施實施方案中，提供在β位有經(jīng)保護或未經(jīng)保護的硫醇基及 取代基R 1的D-或L-非天然型氨基酸衍生物[其中，R1是指構(gòu)成氨基酸的側(cè)鏈的取代基中， 結(jié)合在β碳原子的取代基部分而言（但，氫原子的情況除外）。]的制造方法。
[0023] 此外，本發(fā)明的一實施實施方案中，特征在于前述"在β位有經(jīng)保護或未經(jīng)保護的 硫醇基及取代基R 1的D-或L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法"中，
[0024] 在前述步驟（I)中，前述反應(yīng)（A)之前，包含作為步驟（P)之制造在β碳原子有 取代基R 1及脫離基L的氨基酸衍生物的步驟，
[0025] 前述反應(yīng)（A)是與使前述脫離基L脫離氨基酸衍生物的β碳原子的反應(yīng)一起實 施。
[0026] 此外，本發(fā)明的一實施實施方案中，特征在于前述取代基R1是芳族取代基，前述步 驟（P)包含作為步驟（P-I)之對在β碳原子有取代基R 1的氨基酸衍生物，在β碳原子導(dǎo) 入脫離基L的步驟。
[0027] 此外，本發(fā)明的一實施實施方案中，特征在于前述步驟（P)，包含作為步驟（Ρ-2) 之使甘氨酸與以R1CHO代表的醛化合物反應(yīng)的步驟。
[0028] 此外，本發(fā)明的一實施實施方案中，特征在于前述步驟（B)是，將結(jié)合在該氨基酸 衍生物的α碳原子的氨基變換為?；被姆磻?yīng)，在前述步驟（II)中的D-或L-氨基酸 選擇性水解酶是D-或L-氨基酰化酶（aminoacylase)。
[0029] 此外，本發(fā)明的一實施實施方案中，特征在于在前述步驟（II)中，分離經(jīng)水解的 D-或L-氨基酸衍生物的步驟，含有對經(jīng)水解的D-或L-氨基酸衍生物導(dǎo)入脂溶性保護基的 步驟，由因脂溶性保護基的有無而產(chǎn)生的疏水性的差異，分離經(jīng)導(dǎo)入脂溶性保護基的D-或 L-氨基酸衍生物的步驟。
[0030] 此外，本發(fā)明的一實施實施方案中，特征在于在β位有經(jīng)保護或未經(jīng)保護的硫醇 基的D-非天然型氨基酸衍生物的制造方法，在前述步驟（II)中，使用D-氨基酸選擇性水 解酶，隨后分離經(jīng)水解的D-氨基酸衍生物。
[0031] 此外，本發(fā)明的一實施實施方案中，特征在于在β位有經(jīng)保護或未經(jīng)保護的硫醇 基的L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法，在前述步驟（II)中，使用L-氨基酸選擇性水 解酶，隨后分離經(jīng)水解的L-氨基酸衍生物。
[0032] 此外，本發(fā)明的一實施實施方案中，特征在于在前述步驟（A)中導(dǎo)入的硫醇基是 經(jīng)從PMB (對甲氧基芐基）、Acm(乙酰氨基甲基）、芐基、Trt (三苯甲基）、二硫代、叔丁基選 出的保護基所保護的硫醇基。
[0033] 此外，本發(fā)明的一實施實施方案中，提供在β位有經(jīng)保護或未經(jīng)保護的硫醇基的 經(jīng)光學(xué)拆分的D-非天然型氨基酸衍生物及L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法，該制造 方法含有以下步驟，
[0034] (I)對氨基酸衍生物，實施以下的反應(yīng)，而制造含有D-型及L-型，在β位有經(jīng)保 護或未經(jīng)保護的硫醇基的氨基酸衍生物的步驟
[0035] (A)在該氨基酸衍生物的β碳原子導(dǎo)入經(jīng)保護或未經(jīng)保護的硫醇基的反應(yīng)，
[0036] 以及，
[0037] (B)將結(jié)合在該氨基酸衍生物的α碳原子的氨基或羧基，變換為要成為D-或 L-氨基酸選擇性水解酶的基質(zhì)的取代基的反應(yīng)，
[0038] (II)對于（I)所得的氨基酸衍生物，使D-氨基酸選擇性水解酶反應(yīng)，隨后分離經(jīng) 水解的D-氨基酸衍生物的步驟，
[0039] 以及，
[0040] (III)水解在（II)未經(jīng)水解的L-氨基酸衍生物，隨后獲得經(jīng)水解的L-氨基酸衍 生物的步驟。
[0041] 此外，本發(fā)明的一實施實施方案中，提供在β位有經(jīng)保護或未經(jīng)保護的硫醇基的 經(jīng)光學(xué)拆分的D-非天然型氨基酸衍生物及L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法，該制造 方法包含以下的步驟，
[0042] (I)對氨基酸衍生物，實施以下的反應(yīng)，制造包含D-型及L-型之在β位有經(jīng)保護 或未經(jīng)保護的硫醇基的氨基酸衍生物的步驟
[0043] (A)在該氨基酸衍生物的β碳原子導(dǎo)入經(jīng)保護或未經(jīng)保護的硫醇基的反應(yīng)，
[0044] 以及，
[0045] (B)將結(jié)合在該氨基酸衍生物的α碳原子的氨基或羧基，變換為要成為D-或 L-氨基酸選擇性水解酶的基質(zhì)的取代基的反應(yīng)，
[0046] (II)對于（I)所得的氨基酸衍生物，使L-氨基酸選擇性水解酶反應(yīng)，隨后分離經(jīng) 水解的L-氨基酸衍生物的步驟，
[0047] 以及，
[0048] (III)水解在（II)未經(jīng)水解的D-氨基酸衍生物，隨后獲得經(jīng)水解的D-氨基酸衍 生物的步驟。
[0049] 此外，本發(fā)明的一實施實施方案中，提供在β位有經(jīng)保護或未經(jīng)保護的硫醇基之 經(jīng)光學(xué)拆分的D-非天然型氨基酸衍生物及L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法，
[0050] 前述步驟（B)是將在該氨基酸衍生物的α碳原子結(jié)合的氨基，變換為?；被?反應(yīng)，
[0051] 在步驟（II)所述的"（I)所得的氨基酸衍生物"是包含以下的式所代表之關(guān)于α 碳原子的D-型及L-型的組合物
[0053][其中，R2代表氫原子或硫醇基的保護基，X代表經(jīng)保護或未經(jīng)保護的羧基，Acyl 表示酰基，R1表示構(gòu)成氨基酸的側(cè)鏈的取代基中，結(jié)合在β碳原子的取代基部分（但，氫原 子的情況除外）。]，
[0054] 前述步驟（II)中，D-或L-氨基酸選擇性水解酶是D-或L-氨基?；浮?br>[0055] 此外，本發(fā)明的另外的實施實施方案，提供包含以下式所代表之關(guān)于氨基酸衍生 物的α碳原子的D-型及L-型的組合物
[0057] [其中，R2代表氫原子或硫醇基的保護基，X代表經(jīng)保護或未經(jīng)保護的羧基，Acyl 表示?；?，R1表示構(gòu)成天然型氨基酸的側(cè)鏈的取代基中，在β碳原子結(jié)合的取代基部分 (但，氫原子的情況除外）。]。此外，這種氨基酸衍生物亦可為前述式所代表的化合物的鹽。
[0058] 此外，本發(fā)明的一實施實施方案中，特征在于包含前述式所代表之關(guān)于氨基酸衍 生物的α碳原子的D-型及L-型的組合物中，前述取代基R 1是結(jié)合在由Arg、Asn、Asp、 6111、61]1、把8、1^11、1^8、]^1:、？116、1'印、及171'所成的群選出的氨基酸的0碳原子的取代 基部分（但，不是氫原子）。
[0059] 此外，本發(fā)明的一實施實施方案中，特征在于包含前述式所代表之關(guān)于氨基酸衍 生物的α碳原子的D-型及L-型的組合物中，前述取代基R 2是硫醇基的保護基。
[0060] 此外，本發(fā)明的一實施實施方案中，特征在于包含前述式所代表之關(guān)于氨基酸衍 生物的α碳原子的D-型及L-型的組合物中，前述取代基X是C00H。
[0061] 此外，本發(fā)明的一實施實施方案中，特征在于包含前述式所代表之關(guān)于氨基酸衍 生物的α碳原子的D-型及L-型的組合物中，前述取代基R 1是結(jié)合在由Arg、Asn、Asp、 6111、61]1、把8、1^11、1^8、]^1:、？116、1'印、及171'所成之群選出的氨基酸的0碳原子的取代 基部分（但，不是氫原子），前述取代基R 2是硫醇基的保護基，前述取代基X是C00H。
[0062] 此外，本發(fā)明的一實施實施方案中，特征在于包含前述式所代表之關(guān)于氨基酸衍 生物的α碳原子的D-型及L-型的組合物是前述D-型及L-型的等量混合物。
[0063] 此外，本發(fā)明的一實施實施方案中，提供在β位有經(jīng)保護或未經(jīng)保護的硫醇基及 取代基R1之D-或L-非天然型氨基酸衍生物[其中，R 1是指芳族取代基而言。]的制造方 法，而含有以下的步驟，
[0064] (I)對氨基酸衍生物，實施以下的步驟，制造含有D-型及L-型，在β位有經(jīng)保護 或未經(jīng)保護的硫醇基的氨基酸衍生物的步驟
[0065] (P-ι)對于在β碳原子有取代基R1的氨基酸衍生物，在該β碳原子導(dǎo)入脫離基 L，制造在β碳原子有取代基R1及脫離基L的氨基酸衍生物的步驟，
[0066] (A)由該氨基酸衍生物的β碳原子使前述脫離基L脫離，且，在該β碳原子導(dǎo)入 經(jīng)保護或未經(jīng)保護的硫醇基的步驟，
[0067]以及，
[0068] (B)將該氨基酸衍生物之α碳原子結(jié)合的氨基或羧基，變換成為D-或L-氨基酸 選擇性水解酶的基質(zhì)的取代基步驟，
[0069] 以及，
[0070] (II)對于（I)所得的氨基酸衍生物，使D-或L-氨基酸選擇性水解酶反應(yīng)，隨后分 離經(jīng)水解的D-或L-氨基酸衍生物的步驟。
[0071] 此外，本發(fā)明的一實施實施方案中，提供在β位有經(jīng)保護或未經(jīng)保護的硫醇基及 取代基R 1之D-或L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法[其中，R 1是指構(gòu)成氨基酸的側(cè)鏈 的取代基中，結(jié)合在β碳原子的取代基部分而言（但，除氫原子的情況）。]，而含有以下的 步驟，
[0072] (I)對氨基酸衍生物，實施以下的步驟，制造含有D-型及L-型之在β位有經(jīng)保護 或未經(jīng)保護的硫醇基的氨基酸衍生物的步驟
[0073] (Ρ-2)使甘氨酸與以R1CHO代表的醛化合物反應(yīng)，制造在β碳原子有取代基R 1及 脫離基L的氨基酸衍生物的步驟，
[0074] (A)由該氨基酸衍生物的β碳原子使前述脫離基L脫離，且，在該β碳原子導(dǎo)入 經(jīng)保護或未經(jīng)保護的硫醇基的步驟，
[0075] 以及，
[0076] (B)將該氨基酸衍生物的α碳原子結(jié)合的氨基或羧基，變換成為D-或L-氨基酸 選擇性水解酶的基質(zhì)的取代基的步驟，
[0077] 以及，
[0078] (II)對于（I)所得的氨基酸衍生物，使D-或L-氨基酸選擇性水解酶反應(yīng)，隨后分 離經(jīng)水解的D-或L-氨基酸衍生物的步驟。
[0079] 此外，本發(fā)明的一實施實施方案中，特征在于在β位有經(jīng)保護或未經(jīng)保護的硫醇 基之D-或L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法中，原料是使用包含關(guān)于α碳原子的D-型 及L-型的氨基酸衍生物，或，α碳原子不是不對稱碳原子的氨基酸衍生物。
[0080] 此外，本發(fā)明的一實施實施方案中，特征在于在β位有經(jīng)保護或未經(jīng)保護的硫醇 基之D-或L-非天然型氨基酸衍生物的制造方法中，原料是使用關(guān)于α碳原子的D-體及 L-型的等量混合物之氨基酸衍生物，或，α碳原子不是不